Après en temps réel l'impact des facteurs de virulence contre le pneumocoque dans une souris modèle pneumonie aiguë avec bactéries bioluminescentes
Summary
Streptococcus pneumoniae est l'agent pathogène menant pneumopathies sévères acquis communautaire et responsable de plus de 2 millions de décès dans le monde. L'impact des facteurs bactériens impliqués dans la virulence de remise en forme ou peut être contrôlé en temps réel dans une pneumonie ou une bactériémie modèle de souris en utilisant des bactéries bioluminescentes aiguë.
Abstract
La pneumonie est l'un des principaux problèmes de santé dans les pays en développement et les pays industrialisés et est associée à une morbidité et une mortalité considérables. Malgré les progrès dans la connaissance de cette maladie, la disponibilité des unités de soins intensifs (USI), et l'utilisation d'agents antimicrobiens puissants et des vaccins efficaces, les taux de mortalité restent élevés 1. Streptococcus pneumoniae est le principal agent pathogène de la pneumonie communautaire (PAC) et l'une des causes les plus courantes de bactériémie chez l'homme. Cet agent pathogène est équipé d'un arsenal de adhésines de surface exposée et facteurs de virulence qui contribuent à la pneumonie et les maladies invasives à pneumocoques (IIP). L'évaluation du rôle in vivo de facteurs de forme physique ou virulence bactérienne est de la plus haute importance à démêler S. mécanismes de pathogénicité pneumoniae. Les modèles murins de la pneumonie, la bactériémie et la méningite sont utilisés pour déterminer l'impact des facteurs de pneumocoques à différents stades de l'infection. Ici, nous décrivons un protocole pour surveiller en temps réel la diffusion pneumocoque chez la souris après des infections par des bactéries bioluminescentes intrapéritonéale ou intranasale. Les résultats montrent la multiplication et la diffusion des pneumocoques dans les voies respiratoires inférieures et du sang, qui peut être visualisée et évaluée en utilisant un système d'imagerie et le logiciel d'analyse d'accompagnement.
Introduction
Infections des voies respiratoires causées par des virus ou des bactéries restent l'un des problèmes les plus courants cliniques acquis communautaires ou à travers le monde causant environ un tiers de tous les décès dans le monde. Les espèces bactériennes clés sont Haemophilus influenzae et Streptococcus pneumoniae 2. Cependant, ces espèces bactériennes sont habituellement des constituants communs de la flore naturelles respiratoires des voies. Ainsi chariot de bactéries est également certain risque de maladie invasive et en fonction de l'état immunitaire ou prédispositions des individus. La colonisation asymptomatique est déclenché pour les infections invasives. Streptococcus pneumoniae est le principal agent pathogène de la pneumonie communautaire (PAC) et l'une des causes les plus courantes de bactériémie chez les humains. Chez les individus sains S. pneumoniae (pneumocoque) sont souvent asymptomatiques colonisateurs et inoffensifs des voies respiratoires supérieures, où ils sont confrontés à des bactéries non pathogènesde la flore résidente, mais aussi par des agents pathogènes tels que Haemophilus spp. ou Staphylococcus aureus et la première ligne du système immunitaire humain de la défense. Les taux de portage sont les plus élevés chez les jeunes enfants (37%) et encore plus élevé dans les centres de soins de jour bondés (58%) 3-5. La population la plus jeune et les personnes âgées recevant le pneumocoque par la transmission par aérosol des transporteurs et des sécrétions naso-pharyngées 6, appartiennent à des groupes à haut risque et la vaccination à l'aide de l'un des vaccins antipneumococciques conjugués (de PCV10 ou PCV13 chez les enfants et 23-valent polysaccharide PPSV23 chez les adultes) Il est recommandé aux États-Unis (US) et de nombreux pays européens 4. Le PPSV23 couvre sérotypes responsables de ~ 90% des maladies pneumococciques bactériémiques aux États-Unis et en Europe, la prévention des maladies pneumococciques invasives ainsi efficacement (IPD) chez les adultes, tandis que les PCVs couvrent les sérotypes les plus fréquents chez les enfants. Par conséquent, IPD en raison de types de vaccins (VT) sont redusérotypes non vaccinaux ced mais présentant un potentiel de virulence élevée et résistance aux antibiotiques ont émergé 4,7-12. Le nasopharynx que le réservoir est le point de départ pour les pneumocoques se propager aux sinus ou des oreilles moyennes initiateurs infections locales dangereuses. Plus important encore, les pneumocoques se propager directement par la voie aérienne pour les bronches et les poumons entraînant mortelle PAC 4,13. Les infections pulmonaires sont souvent accompagnés de tissus et destruction de la barrière, permettant ainsi à l'agent pathogène de se propager dans le sang et provoquer IPD. Les incidences de la PAC et IPD sont les plus élevés chez les personnes immunodéprimées ou aux extrêmes de 4,13 ans. Les circonstances responsables de la conversion d'un commensal à un agent pathogène à haute virulence sont encore en discussion. Toutefois, outre l'évolution de la sensibilité de l'hôte et adaptation évolutive accompagnée de virulence plus élevée et l'augmentation des résistances aux antibiotiques ont été suggéré d'avoir un impact crucial sur pneinfections umococcal 14-16.
L'agent pathogène est doté d'une multiplicité d'adhésines médiatrices contact intime de cellules épithéliales des muqueuses. Après avoir surmonté le mucus des voies respiratoires, l'adhésion des pneumocoques à des cellules hôtes est facilitée par l'intermédiaire d'interactions directes des adhésines de surface exposée avec des récepteurs cellulaires et en exploitant des composants de la matrice extracellulaire ou des protéines sériques comme des molécules de pontage 4,17,18. Pathogènes polyvalents pneumocoques sont également équipées de facteurs impliqués dans l'évasion des mécanismes de défense immunitaire de l'hôte. En outre, ils ont la capacité de s'adapter à différents milieux d'accueil tels que les poumons, le sang et le liquide céphalo-rachidien (LCR), respectivement 5,17,19,20.
L'impact des facteurs bactériens sur les réponses de la pathogenèse et d'accueil inflammatoire est étudiée dans des modèles animaux expérimentaux de la pneumonie, la bactériémie, la méningite ou 21-25. En dépit d'être un agent pathogène humain, ces modèles sont nousll établi à déchiffrer tropisme pneumocoque de tissu, les mécanismes de virulence, ou protectivity de candidats vaccins contre le pneumocoque. Le fond génétique des souches de souris consanguines détermine la susceptibilité à pneumocoques. Des souris BALB / c infectées par voie intranasale les pneumocoques se sont révélés être résistants, alors que les souris CBA / Ca et SJL étaient plus sensibles contre les infections à pneumocoque 22. Cela implique que, comme pour les humains, la génétique et les mécanismes de défense de l'hôte de déterminer le résultat de l'infection. Par conséquent, des efforts supplémentaires sont nécessaires pour démêler locus de résistance dans le génome de la souris moins sensibles aux infections pneumococciques. Les résultats ont conduit à des changements in vivo dans des protocoles de virulence. Au lieu des souris BALB / c consanguines souvent utilisés dans le passé, les souches de souris consanguines très sensibles de CD-1/MF1 sont aujourd'hui souvent utilisées pour étudier l'effet de la virulence ou d'adaptation à pneumocoques perte de fonction de facteurs 26-28. En outre, la disponibilitédes pneumocoques bioluminescentes et techniques d'imagerie optique permet en temps réel bioluminescence bio-imagerie des infections. En pneumocoques la cassette du gène luxABCDE optimisé (plasmide Paul-A Tn 4001 luxABCDE Km r) a été inséré dans un site unique d'insertion du chromosome par mutagénèse par transposon. Pneumocoques Bioluminescent ont été employés pour évaluer l'atténuation de mutants pneumococciques virulence ou déficients en facteurs de remise en forme et de leur translocation d'un site anatomique dans un autre 26,28-31.
Ici, nous fournissons un protocole pour la bio-imagerie des infections à pneumocoque dans une pneumonie murine ou modèle de septicémie. L'amplification et la diffusion des pneumocoques chez des souris par voie intranasale bioluminescent ou infectées par voie intrapéritonéale peuvent facilement être contrôlées au cours du temps en utilisant un système d'imagerie optique et le même animal, à différents points dans le temps.
Protocol
Representative Results
Discussion
Toutes les expériences menées sur des animaux doivent être approuvés par les autorités locales et les commissions d'éthique. Expériences in vivo d'infection dans la charge bactérienne dans les différents créneaux d'accueil des animaux infectés doit être déterminée à différents moments après l'infection. Dans ces conditions expérimentales, les animaux doivent être sacrifiés avant l'isolement des bactéries à partir du sang, du nasopharynx, lavage bronchoalv…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
La recherche dans le laboratoire a été financé par des subventions de la Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG HA 3125/3-2, 3125/4-2 DFG HA) et le ministère fédéral de l'Éducation et de la Recherche (BMBF) génomique d'infection médicale (FKZ 0315828A) à SH.
Materials
| Todd Hewitt broth | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | X936.1 | |
| Yeast extract | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | 2363.2 | |
| Blood agar plates | Oxoid, Wesel, Germany | PB5039A | |
| Kanamycin | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | T832.2 | |
| Erythromycin | Sigma-Aldrich,Taufkirchen, Germany | E6376 | |
| fetal bovine serum (FBS) | PAA Laboratories, Coelbe, Germany | A11-151 | |
| CD-1 mice, female | Charles River, Sulzfeld, Germany | CD1SIFE06W08W | female CD-1 mice, six to eight weeks old |
| Ketamin 500mg, Curamed injection solution | Schwabe-Curamed, Karlsruhe, Germany | ||
| Rompun 2%, injection solution | Bayer Animal Health, Monheim, Germany | ||
| BD Plastipak 1 ml syringes | Becton Dickinson, Heidelberg, Germany | 300015 | sterile Luer-Lok™ syringes with needle |
| Gel Loader Tips | peqlab | 81-13790 | MµltiFlex™ Tips |
| Hyaluronidase | Sigma-Aldrich | H3884-100mg | Hyaluronidase Type IV-S from Bovine test |
| Oxygen | Air Liquide, Düsseldorf, Germany | M1001L50R2A001 | |
| Isofluoran | Baxter, Unterschleißheim, Germany | ||
| pGEM-T Easy | Promega, Mannheim, Germany | ||
| Oligonucleotides | Eurofins MWG, Ebersberg, Germany | ||
| Qiaprep Spin Midiprep Kit | Qiagen, Hilden, Germany | 27104 | |
| PCR DNA purification kit | Qiagen, Hilden, Germany | 28106 | |
| Equipment | |||
| Living Image 4.1 software | Caliper Life Sciences/PerkinElmer, Rodgau, Germany | ||
| XGI-8 Gas Anesthesia System | Caliper Life Sciences/PerkinElmer, Rodgau, Germany | ||
| IVIS Spectrum Imaging System | Caliper Life Sciences/PerkinElmer, Rodgau, Germany | ||
| Biophotometer | Eppendorf AG, Hamburg, Germany |
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