맹장 결찰 및 마우스에서 autophagy에 공부를 모델로 패혈증 관통 유도
Summary
실험 패혈증은 맹장 결찰과 천자 (CLP) 방법을 사용하여 마우스에서 유발 될 수있다. CLP – 유도 패혈증의 컨텍스트에서 생체에 autophagy를 평가하는 현재의 프로토콜이 여기에 제시된다 : (GFP) – LC3 마우스를 사용 autophagy에 측정을위한 프로토콜, 및 전자 현미경에 의해 autophagosome 형성을 측정하기위한 프로토콜.
Abstract
실험 패혈증은 맹장 결찰과 천자 polymicrobial 패혈증 발생 (CLP) 방법을 사용하여 마우스에서 유발 될 수있다. 여기서, 프로토콜 CLP 기술을 사용하여 마우스에 다양한 중증도의 패혈증을 유발하도록 제공된다. autophagy에 스트레스와 병원균 침입에 대한 근본적인 조직의 반응이다. 실험 패혈증의 맥락에서 생체 내에서 autophagy에를 평가하기 위해 현재의 두 프로토콜도 여기에 표시됩니다. (I), 녹색 형광 단백질 (GFP) – LC3 융합 단백질을 발현하는 형질 전환 마우스는 CLP을 실시한다. GFP 신호 (puncta에)의 현지화 강화는 면역 또는 공 촛점 분석에 의해 하나 정량으로, 향상된 autophagosome 형성을 감지하고, autophagy에 경로의 따라서 변경 활성화하는 데 사용할 수 있습니다. (autophagy에 자극 마커 등) 단위 조직 면적당 (II) 향상된 autophagic 액포 (autophagosome) 형성은 전자 현미경을 사용하여 정량화 될 수있다. 패혈증 autophagic 반응의 연구는 중요한 샘플입니다조직이 감염에 반응하는 메커니즘을 이해 onent. 이 지역에있는 연구 결과는 궁극적 중요한 치료 의학의 주요 문제를 나타내는 패혈증의 발병 기전을 이해에 기여할 수있다.
Introduction
패혈증, 감염에 대한 전신 염증 반응은 비판적으로 아픈 환자 1에서 사망의 주요 원인을 나타냅니다. 자주 polymicrobial 패혈증에 이르는 복강 내 감염, 최대 60 % 2의 상당한 사망률이있는, 패혈증 케이스의 20 %를 차지하고있다. 패혈증 관련 사망률은 주로 다음 장기 부전 3,4에 다 장기 부전의 결과. 이 질병의 발병 메커니즘에 추가적인 조사가 급하게 신규하고보다 효과적인 치료법의 개발을 촉진하기 위해 필요하다.
맹장 결찰술 및 천자 (CLP) 방법은 생체 내에서 모델링 패혈증 일반적으로 사용되는 절차입니다. 궁극적으로 맹장 박테리아 가득으로, polymicrobial 복막염에서의 천자 결과, 혈액 (균혈증)에 박테리아의 전위, 패 혈성 쇼크, 다 장기 부전 및 사망 5. 그것은 일반적으로 CLP 임상 반영 접수더 정확하게 설치류에 독소 또는 정제 된 박테리아의 주사와 같은 이전 기술보다 현실 따라서, CLP는 패혈증의 발병 기전의 조사, 따라서 실험 유도 6 (하지 제한없이이기는하지만) 황금 표준으로 간주된다. 이 논문에서, 우리는 패혈증의 발병 메커니즘은 autophagy에 포함 여부를 평가하기위한 프로토콜을 설명합니다.
autophagy에, 진화 적으로 보존 된 휴대 과정은 손상된 단백질과 같은 미토콘드리아 같은 세포 내 소기관의 턴 오버를 촉진하고 세균 7,8 등의 세포 내 병원균의 정리에 중요한 역할을합니다. autophagy를하는 동안, 세포 내 단백질이나 세포 소기관은 이후 저하 9의 리소좀에 전달 autophagosomes라는 이중 막 결합 소포로 압수됩니다. 단백질의 수는 autophagy에 관련 유전자의 포유 동물 동족체 (ATG)으로 식별 된,원래는 autophagy의 과정을 조절하는 효모에서 발견. LC3B-I (자유 양식)에서 미세 소관 관련 단백질 1 경쇄 3B (LC3B) (Atg8의 상동)의 변환 (포스파티딜 에탄올 아민 – 복합 양식)-II를 LC3B하려면 autophagosome 형성 9에있는 중요한 단계를 나타냅니다. Autophagic 장애는 노화와 암, 신경 퇴행성 질환 (10)을 포함하여 인간의 질병과 연관되어 있습니다. 또한, autophagy에는 면역 세포 (8)에 의해 항원 프레 젠 테이션, 림프구 개발과 사이토 카인의 분비와 같은 타고난 및 적응 면역에 영향을 미칩니다. 따라서, autophagy에 또한 감염에 전신 염증 반응 (즉, 패혈증)에 역할을 할 수 있다는 합리적인 것 같다.
지금까지 여러 가지 방법이 생체 내에서 조직 손상에 autophagy에의 역할을 평가하기 위해 기술되었다. 이들은 녹색 형광 단백질 (GFP) LC3 표현 생쥐의 사용과 자동의 정량화를 포함전자 현미경으로 조직 된 phagosomes는 (이 두 가지 방법은이 논문에서 설명합니다). 추가 방법은 조직 균질 autophagic 단백질 발현의 정량화하고, (다른 곳에서 설명) autophagic 플럭스의 분석 11 ~ 13 있습니다. 이 검토의 목적은 실험 패혈증의 컨텍스트에서 생체 내 autophagy에 대한 평가를 위해 현재의 프로토콜을 제공하는 것이다.
Protocol
Representative Results
Discussion
CLP의 주요 장점은 연구원이 (저에 대한 중간 및 높은 수준에서 즉) 다른 심각도의 패혈증을 조사 할 수 있다는 것입니다. 유도 패혈증의 심각도는 맹장 결찰의 길이 (가장 중요한 결정 인자)에 의해 영향을받는, 천자 사용 바늘의 크기와 구멍의 수는 15을 수행 하였다. 또한, 마우스의 피로와 성별은 패혈증의 정도에 영향을 미칠 수 있으며, 몇 가지 계통이 다른 사람보다 더 민감하고…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Materials
| GFP-LC3 Transgenic Mice | Riken (Japan) | RBRC00806 | GFP-LC3#53 |
| Xylazine | Henry-Schein | 568-0606 | Xylazine HCl Injection Vet |
| Ketamine | Henry-Schein | 995-2949 | Ketaset Inj 100 mg/ml |
| EtOH | Fisher | A405-20 | Histology Grade |
| EtOH | Fisher | A407-1 | For Sterilizatiion |
| silk surgical sutures 6-0 | Owens & Minor | 2300-0078OG, 017624 | |
| buprenorphine-HCl | Henry-Schein | 614-5157 | Buprenex Ampules |
| paraformaldehyde (37%) solution | JT Baker | S898-09 | |
| xylenes | Fisher | X3P-1GAL | |
| anti-GFP monoclonal antibody | Life Technologies | G10362 | |
| Hoescht | Sigma | 944403 | |
| DAPI | Invitrogen | D1306 | |
| OCT | VWR scientific | 25608-930 | |
| Sudan Black | Santa Cruz | sc-203760 | |
| EM grade Glutaraldehyde 2.5% in sodium cacodylate | Electron microscopy Sciences | 15960 | |
| propylene oxide | Sigma | 240397 | |
| Agar 100 resin | Agar scientific | R1045 | |
| dodecenylsuccinic anhydride | Sigma | 46346 | |
| methylnadic anhydride | Sigma | 45359 | |
| N-benzyldimethylamine | Sigma | 185582 |
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