In Vivo Two-Photon Microscopia de terminações nervosas individuais em Pele
Summary
O protocolo para a imagem latente longitudinal dinâmico e lesão seletiva a laser de terminações nervosas em repórter camundongos transgênicos é apresentado.
Abstract
Terminações nervosas na pele estão envolvidas em processos fisiológicos, tais como detecção de 1, bem como em processos patológicos tais como a dor neuropática 2. Seu posicionamento close-to-superfície facilita a imagem microscópica de terminações nervosas da pele na vida animal intacto. Utilizando microscopia multifóton, é possível obter imagens finas superando o problema de dispersão de luz forte do tecido da pele. Repórter ratinhos transgénicos que expressam EYFP sob o controlo do promotor Thy-1 (incluindo os neurónios na periferia neurónios sensoriais) são bem adequados para os estudos longitudinais de terminações nervosas individuais durante longos períodos de tempo até vários meses ou até mesmo ao longo da vida. Além disso, utilizando-se o mesmo laser femtosecond como para a criação de imagens, é possível produzir lesões altamente selectivos de fibras nervosas para os estudos sobre a reestruturação da fibra nervosa. Aqui, apresentamos um protocolo simples e confiável para multiphoton longitudinal in vivo de imagens emicrocirurgia laser baseado no rato terminações nervosas da pele.
Introduction
Terminações nervosas cutâneas sofrer alterações dinâmicas em diferentes estados fisiopatológicos. As fibras nervosas podem passar pelo processo de degeneração e regeneração ou reestruturação no curso de doenças como neuropatia periférica 2 ou Morton neuroma 3. Após lesão traumática, uma parte importante de terminações nervosas na pele é dinâmica reinervação da área danificada. No entanto, a abordagem comum para a investigação de terminações nervosas é ex vivo cortes histológicos que carece de informações em tempo real sobre os processos em curso 4. Usando marcadores fluorescentes codificados geneticamente, é possível acompanhar as terminações nervosas na pele de animais vivos, obtendo informação rica e significativamente mais relevantes sobre as mudanças estruturais. A investigação de terminações nervosas cutâneas é possível usando microscopia de fluorescência convencional, no entanto, a dispersão de luz forte do tecido da pele prejudica fortemente a qualidadedos dados adquiridos 5. Microscopia multiphoton permite a aquisição de imagens de alta resolução nos tecidos fortemente espalhamento devido à soma não-linear de energia de fótons de luz de excitação, resultando em emissão de fluorescência só do ponto focal da objetiva. Este efeito conduz a um forte aumento da profundidade de penetração e melhoria da relação sinal-ruído para a medição em tecidos da pele 6. Usando o mesmo laser como de imagiologia, é possível produzir dissecção selectiva das fibras nervosas 7. No seguinte protocolo que mostram o método de imagiologia longitudinal de terminações nervosas cutâneas in vivo em ratos transgénicos repórter combinado com lesão selectiva a laser disponíveis no comércio usando sistema multifóton microscópio.
Protocol
Representative Results
Discussion
Neste protocolo de vídeo que demonstrar o método não-invasivo para longitudinal dois fótons de terminações nervosas individuais.
A dinâmica de inervações da pele é afetada em doenças como psoríase e neuropatia periférica 2, e em lesões traumáticas 9. Dois fótons permite a análise detalhada das estruturas de fibras nervosas na matriz de colágeno. A utilização de ratinhos transgénicos repórter ajuda a evitar os problemas relacionados com a coloraçã…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores gostariam de agradecer Neurotar Ltd. para a assistência técnica, a Fundação CIMO e FGSN de apoio financeiro.
Materials
| Round cover glass | Electron Microscopy Science | 72296-05 | 5 mm diameter #1.5 thickness |
| Eye drops Viscotears | Novartis | 2mg/g | |
| Superglue Loctite 401 | Henkel | 135429 | |
| Ketaminol | Intervet | Ketamine 50 mg/ml, working solution 10 mg/ml (use it 80 µg per gramm of animal weight) | |
| Rompun | Bayer Healthcare | Xylazine 20 mg/ml, working solution 1.25 mg/ml (use it 10 µg per gramm of animal weight) | |
| Working solution is a mixture of Ketamine 10 mg/ml and Xylazine 1.25 mg/ml in PBS | |||
| Ethanol 70% | |||
| Distilled water or Milli-Q water | |||
| Syringes 1ml | BD | 300013 | |
| 30G 1/2" needles | BD | 304000 | |
| Plastic packaging material | Could be purchaized from general hardware store | ||
| FV-1000MPE microscope | Olympus | FV-1000MPE | Microscope with motorized stage and rigid metal bar for fixation |
| 25X XLPlan objective | Olympus | XLPLN 25XWMP | Water imersion objective optimized for multiphoton imaging |
| Mai-Tai DeepSee laser (2W) | SpectraPhysics | ||
| Heating pad | Supertech | TMP-5b | Heating pad with a temperature controller |
| Metal ring fixator | Neurotar Ltd. | ||
| ImageJ | NIH | Open source software for image processing and analysis, http://rsbweb.nih.gov/ij/ | |
| Thy1-YFPH mice strain | JaxLab | 003782 |
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