Agro-infiltratie en PVX-agro-infectie zijn routinematige functionele assays voor voorbijgaande ectopische expressie van genen in planten. Deze methoden zijn efficiënte assays in effectoromics strategieën (snelle weerstand en avirulence gen ontdekking) en cruciaal voor modern onderzoek in moleculaire plant pathologie. Ze voldoen aan de vraag naar robuuste functionele analyse met hoge doorvoer in fabrieken.
Agro-infiltratie en PVX-agro-infectie zijn twee efficiënte transiënte expressietesten voor functionele analyse van kandidaatgenen in planten. Het meest gebruikte middel voor agro-infiltratie is Agrobacterium tumefaciens, een ziekteverwekker van veel dicot plantensoorten. Dit houdt in dat agro-infiltratie op veel plantensoorten kan worden toegepast. Hier presenteren we onze protocollen en verwachte resultaten bij het toepassen van deze methoden op de aardappel(Solanum tuberosum),de gerelateerde wilde knoldragende Solanum-soorten (Solanum-sectie Petota)en de modelplant Nicotiana benthamiana. Naast functionele analyse van enkelvoudige genen, zoals resistentie (R) of avirulentie (Avr) genen, is de agro-infiltratietest zeer geschikt voor het samenvatten van de R-AVR interacties geassocieerd met specifieke gastheer pathogene interacties door simpelweg R en Avr transgenen in dezelfde cel te leveren. Sommige plantennotypes kunnen echter niet-specifieke afweerreacties op Agrobacteriumoproepen, zoals we bijvoorbeeld hebben waargenomen voor verschillende aardappelnotypes. In vergelijking met agro-infiltratie is detectie van AVR-activiteit met PVX-agro-infectie gevoeliger, meer high-throughput in functionele schermen en minder gevoelig voor niet-specifieke afweerreacties op Agrobacterium. Echter, niet-specifieke verdediging tegen PVX kan optreden en er is een risico om reacties te missen als gevolg van virus-geïnduceerde extreme weerstand. Ondanks dergelijke beperkingen zijn agro-infiltratie en PVX-agro-infectie in onze ervaring zowel geschikte als complementaire assays die tegelijkertijd kunnen worden gebruikt om elkaars resultaten te bevestigen.
Effectoromics, een high-throughput functionele genomicabenadering is onlangs naar voren gekomen als een krachtig hulpmiddel om resistentie (R) genen in gewasplanten en bijpassende avirulentie (Avr) genen van pathogenen1-4te identificeren . In tegenstelling tot de meer tijdrovende stabiele transformatie met R-genen, is de effectoromics-strategie gebaseerd op voorbijgaande assays van pathogene gensequenties.
Sinds het genomicatijdperk zijn genomen van plantenpathogenen op grote schaal onderzocht. Bijvoorbeeld voor oomyceten, waaronder de meest verwoestende plantenpathogenen, zijn grote verzamelingen sequenties gegenereerd en geanalyseerd op genen die een rol spelen tijdens de interactie met de plant5-10. Een klasse van pathogene eiwitten vertegenwoordigt effectoren, die de structuur en functie van de gastheercel manipuleren om infectie (virulentiefactoren) te vergemakkelijken of om afweerreacties (avirulentiefactoren) te activeren11-13. Expressie van Avr-genen in plantencellen die R-genen bevatten, resulteert meestal in de overgevoelige celdoodrespons (HR)14,15. In planta kan de uitdrukking van R en Avr genen worden verwezenlijkt gebruikend voorbijgaande uitdrukkingssystemen zoals Agrobacterium tumefaciens –gebaseerde voorbijgaande transformatie (agroinfiltratie)16. Deze transiënte transformatie kan ook worden toegepast in combinatie met virale expressiesystemen (agro-infectie)17,18.
Voor agro-infiltratie is het meest gebruikte middel A . tumefaciens, een breed scala aan pathogenen van dicotplanten. A . tumefaciens bevat een tumor-inducerende (Ti) plasmide. Transfer-DNA (T-DNA) van een Ti plasmide zal in de plantencellen worden omgezet nadat de virulentiemachines van de bacterie zijn geactiveerd. Dit kan worden geactiveerd in gewonde plantencellen, door de vrijgekomen fenolverbindingen met een laag molecuulgewicht en monosaccharaiden in een licht zure omgeving19. Het virulentiegen wordt geactiveerd na de infiltratie van Agrobacterium-suspensuspensingen in bladpanelen die worden gedefinieerd door grote aderen. Vervolgens worden plantencellen in de bladpanelen getransformeerd en drukken ze de transgene(n) uit in het T-DNA-gebied.
Agro-infectie is gebaseerd op geïmplanteerde Agrobacterium, die translocatie van een virus naar plantencellen bemiddelt. Het virus verspreidt zich vervolgens verder naar aangrenzende plantenweefsels, bij afwezigheid van Agrobacterium. Voor agro-infectie kunnen verschillende plantenvirussen worden gebruikt. RNA-virussen zijn ideale vectoren voor genexpressie omdat ze zich kunnen vermenigvuldigen tot zeer hoge niveaus in geïnfecteerde planten. Onder plantaardige RNA-virussen wordt Potato Virus X (PVX) veel gebruikt voor effectoromics-schermen. Om functionele tests voor een ingebracht gen te vergemakkelijken, werden binaire vectoren die het PVX-genoom bevatten geflankeerd door het Bloemkoolmozaïekvirus 35S promotor en de nopaline synthase terminator, gekloond in het T-DNA van A. tumefaciens20. Nadat het T-DNA is overgebracht naar plantencellen, wordt het PVX-genoom in het T-DNA getranscribeerd van de 35S-promotor. Vervolgens verspreiden virusdeeltjes zich systemisch in de geïnfecteerde planten, wat resulteert in de expressie van het ingebrachte gen. Deze methode op basis van zowel Agrobacterium als PVX wordt PVX agro-infectie genoemd.
Hier laten we voorbeelden zien voor zowel de agro-infiltratie als PVX agro-infectietesten. Als waardplanten gebruiken we aardappelkiemplasma(Solanum-sectie Petota),waarvoor effectoromics-benaderingen zijn geïntroduceerd en succesvol zijngebleken 3,4. We gebruiken ook Nicotiana benthamiana, die bekend staat als een modelplant in Solanaceous planten14,21,22.
Voorbijgaande assays zoals agro-infiltratie en agro-infectie zijn efficiënte methoden die essentieel zijn voor modern moleculair plantenpathologisch onderzoek. Ondanks enkele beperkingen voldoen deze methoden aan de vraag naar efficiënte en robuuste functionele analyse met hoge doorvoer in fabrieken.
Het agro-infiltratiesysteem is een veel gebruikte functionele test bij een reeks plantensoorten. Agro-infiltratie vergemakkelijkt de levering van verschillende transgenen in dezelfde cel met gelijktijdige expressie van interagerende eiwitten. Dit is voordelig voor het samenvatten van R-AVR-relaties, door Agrobacterium-stammen te munten die Avr-genen uitdrukken met stammen die de overeenkomende R-genen uitdrukken. Ook voor bekende R-AVR-paren kunnen dergelijke coinfiltraties worden gebruikt als positieve controles. Het opnemen van dergelijke controles is belangrijk omdat in sommige plantgenotypes de transformatie-efficiëntie onder de drempel kan liggen om reacties te detecteren. Het opnemen van negatieve controles, bijvoorbeeld een Agrobacterium stam die een vector zonder gen insert bevat, is ook essentieel om te bepalen of een bepaald plant genotype niet-specifieke afweerreacties op de Agrobacteriumoproept . Deze eigenschap komt met een bepaalde frequentie voor in aardappelkiemplasma, en niet alle Solanum-soorten zijn goed geschikt voor dit op Agrobacteriumgebaseerde expressiesysteem. Over het algemeen werkt de agro-infiltratietest zeer goed in N. benthamiana en de meeste aardappelgenotypes. Naast effectoromics zijn er verschillende andere mogelijke toepassingen voor de agro-infiltratietechniek, zoals de productie van eiwitten uit transgenen en eiwitlokalisatie in plantencellen door confocale microscopie.
PVX agro-infectie is een zeer gevoelig screeningssysteem en meestal meer geschikt voor screenings met hoge doorvoer. Aangezien de Agrobacterium nu alleen lokaal aanwezig is, zijn niet-specifieke reacties op deze bacterie nu niet erg storend, omdat het PVX-virus de verdere verspreiding van het transgene overneemt. Planten kunnen echter resistent zijn tegen PVX of extreme resistentiereacties (ER) monteren, en in dat geval is de agro-infectiemethode niet geschikt. Een andere beperking van de PVX-agro-infectiemethode is de insertgrootte van het interessegen. Waargenomen fenotypes van reacties kunnen variëren van een intense zwarte necrose rond de wond tot zwakke necrose in de buurt van de inentingsvlek. Bij zowel N. benthamiana- als Solanum-soorten wordt PVX-agro-infectie erkend als gevoeliger dan agro-infiltratie.
Rekening houdend met het feit dat de genetische achtergrond van de diverse geteste plantengenotypes enkele beperkingen kan hebben (zie hierboven), krijgen we over het algemeen vergelijkbare conclusies van PVX-agro-infectie en agro-infiltratie. Deze resultaten zijn ook vergelijkbaar met die van andere testresultaten, zoals eiwitinfiltraties29 en ELISA3. Gezien de voordelen en beperkingen van beide systemen, raden we aan beide methoden te gebruiken om elkaar aan te vullen of onafhankelijke resultaten te bevestigen.
The authors have nothing to disclose.
Het werk wordt deels ondersteund door Wageningen University Fund (WUF), China Scholarship Council Program for Graduate Students en een NWO-VIDI-beurs 12378.
Beef extract | Sigma-Aldrich | B4888 | |
Bacteriological peptone | Oxoid | LP0037 | |
Yeast extract | Oxoid | LP0021 | |
MgSO4 | Sigma-Aldrich | 208094 | |
MS salts (without vitamins) | Duchefa Biochemie | M0221 | |
MES | Duchefa Biochemie | M1503 | |
LB broth powder | Sigma-Aldrich | L3022 | |
Acetosyringone | Sigma-Aldrich | D134406 | |
Syringe (1 ml) | BD Plastipak | 300013 | |
Incubator | Infors HT | Multitron II | |
Centrifuge | Heraeus | Multifuge 3S-R | |
Spectrophotometer | Eppendorf | Biophotometer 6131 |