Örneğin çinko parmak nükleazlara (ZFNs) ve transkripsiyon aktivatörü gibi efektör nükleazlara (TALENS) olarak tasarımcı nükleazlar homolog olmayan uç birleştirme (NHEJ) ile homolog yeniden birleştirmeye (HR) yolaklar tetikleyerek fare preimplantasyon embriyoların genomunu değiştirmek için kullanılabilir. Bu gelişmeler kesin genetik değişiklikler farelerde hızlı üretimini sağlar.
Site özel genom değişiklikler (nakavt, knock-in) taşıyan transgenik fareler karmaşık biyolojik sistemleri diseksiyon yanı sıra insan hastalıklarının modelleme ve tedavi stratejileri test etmek için hayati önem taşımaktadır. Böyle çinko parmak nükleazlardır (ZFNs), transkripsiyon aktivatörü gibi efektör nükleazlardır (Talens) ve kümelenmiş düzenli interspaced kısa yineleyen tekrarlar (CRISPR) / için CRISPR-ilişkili (Cas) 9 sistemi yerinde gibi tasarımcı nükleazların kullanımı son gelişmeler Belirli bir genom mühendislik embriyonik kök (ES) hücre teknolojisi güvenmek gerek kalmadan hemen hemen herhangi bir laboratuvar türlerde hızlı hedef genom modifikasyonu gerçekleştirmek için olasılığını açığa çıkarır. Bir genom düzenleme deney tipik olarak tanımlı bir araştırmacı genomik nükleaz aktivitesi yönlendirmek için özel DNA bağlayıcı etki yapımında ardından ilgi konusu bir gen içinde bir tasarımcı nükleaz hedef siteye belirlenmesi ile başlar. Tasarımcı nükleaz plazmidler in vitro olarak '/ Em> döllenmiş fare oosit mikroenjeksiyon için mRNA oluşturmak için transkripsiyonu. Burada, döllenmiş fare oositlerine TALEN mRNA'nın direkt enjeksiyonu ile hedef genom modifikasyonu elde edilmesi için bir protokol sağlar.
Fareler transgenik hayvan modelleri oluşturmak için ana kadar en popüler platform tarafından bulunmaktadır. Fare embriyo 1-3 genetik mühendisliği için çok yönlü bir araç son zamanlarda, örneğin çinko parmak nükleazlara (ZFN) gibi tasarımcı nükleazlara göre genom düzenleme yaklaşımlarla 4-6, transkripsiyon aktivatör gibi efektör nükleazlar (TALEN) 7,8 uzatıldı ve kümelenmiş düzenli interspaced kısa palindromık tekrarlar (CRISPR) / CRISPR-ilişkili (Cas) 9 9. ZFN ve her Fokl endonükleaz 10-12 birleştirilir (sırasıyla çinko parmak proteinlerin dizileri ve tekrar-değişken di-tortuları (RVDs),), iki özel olarak tasarlanmış protein bazlı DNA-bağlayıcı etki çiftleri olarak işlev TALEN. Tersine, Cas9-aracılı DNA parçalanmasının özgüllüğü (aynı zamanda, tek bir kimerik RNA molekülü olarak geçecek kılavuz RNA birleştirilebilir crRNA ve tracrRNA) CRISPR RNA transaktive tarafından sağlanan ile bir kompleks içinde hareket 11CRISPR proteini.
RVDs tanımlanmış bir dizi ile Talens hızla 13-17 seçmek için montaj stratejileri çok sayıda bireysel deneyciler tarafından inşa edilebilir. CRISPR/Cas9 ancak kılavuz RNA-DNA özgünlüğü hala tam 18,19 çözülmüş değil bağlama, tasarımcı nükleazların daha az emek-yoğun nesil vaat ediyor. Özel ZFNs nesil şimdiye kadar uzman akademik laboratuarları ve bu Sangamo Biyobilimlerdeki ve Sigma CompoZr hizmet olarak ticari tedarikçiler ile sınırlı olmuştur.
Genel olarak, tasarımcı nükleazlara ile düzenleme genom sonradan katılan homolog olmayan uç (NHEJ) veya homolog rekombinasyon (HR) DNA onarım makine 10,12 çekmek tanımlanan genomik loci, at çift iplikli sonları (DSB) tanıtmayı amaçlamaktadır. Bir DSB aracılı NHEJ onarım genellikle tamir yerinde yakın eklemeler ve silmeler getirilmesi ile sonuçlanır. Böylece NHEJ onarım cBir genlerin protein kodlama sekansı 4,7,9 içinde bir çerçeve kayma mutasyonu getirerek, bir hedef genin işlevi nakavt için yararlanılabilir. Alternatif olarak, ek veya tanımlanmış genetik bilginin değiştirilmesi tasarımcı nükleazlar ile birlikte bir DNA donör temin edilmesiyle elde edilebilir. Bir DNA donör Böylece HR ile DSB onarım için bir şablon olarak hizmet veren hedef alan ile homoloji bölgeleri ile çevrili araştırmacı tasarlanmış DNA dizileri içerir. Plazmidler 5,6,20 ve tek sarmallı oligonükleotid 8,9,21 Hem verici olarak başarılı bir şekilde kullanılmıştır. NHEJ-nor HR-aracılı genom düzenleme ne genel genetik mimari bozmadan nükleotid sekansında küçük değişikliklere oluşturmak için bu stratejiler özellikle uygun hale getirir, fare embriyo, genomuna bir seçilebilir markerin giriş gerektirir.
Bu protokolde genom düzenleme için gerekli tüm prosedürler açıklanmaktadırTalens kullanılarak fare embriyosu. Bunlar TALEN hedef site 22 1) tanımlanmasını içerir, golden gate klonlama 13 tarafından Talens 2) yapım, TALEN mRNA, döllenmiş fare oosit, embriyo transferi için 5) cerrahi girişimler içine TALEN mRNA 4) mikroenjeksiyon 3) in vitro sentez ve 6) kurucusu hayvanlarda TALEN kaynaklı mutagenez analizi. Biz TALEN mRNA mikroenjeksiyon ve NHEJ kaynaklı eklemeler / silmeler için kurucularından tarama odaklanmak. Bu amaçla plazmid olarak ve fare embriyoları mikro enjeksiyon için TALEN mRNA in vitro sentezi transfekte zaman memeli hücrelerinde hem de ifade edilmesine olanak iki fonksiyonlu TALEN yapıları yarattı. Bu yapılar, heterodimerik Foki kaynaşmış bir kesik TALE omurga 23 Memeli hücrelerinde optimum genom düzenleme için 24,25 etki içermektedir. Bu protokol, aynı zamanda, diğer tasarım nükleazlara mikroenjeksiyonu için veya tasarımcı nükleazlara birleşik enjeksiyon için kabul edilebilirve verici yapıları (DNA donör tasarım Wefers et al. 26,27 ile mükemmel bir teknik yayınlarda tarif edilmiştir).
Etik Bildirimi
Tüm hayvan deneyleri Kanton Zürih Kanton Veteriner Ofisi kurallara ve yönetmeliklere uygun olarak yapıldı.
Tasarımcı Nükleaza odaklı genom düzenleme yaklaşımları önemli ölçüde kendi genomları 10,12 hedeflenen değişiklikler için uygun türlerin yelpazesini genişletmiştir. Farelerde, gen hedefleme ES hücrelerinin iki yıldır standart bir teknik olmuştur; fare ES hücreleri, bazı son başarılı olmuştur, ancak bununla birlikte, bu, fare dışındaki türlerden ES hücrelerine adapte zor olduğu kanıtlanmıştır. Hatta böyle EUCOMM, KOMP veya ZFN ve TALEN yüksek hassasiyet olabilir ve değişiklikler yelpazenin ilgili esneklik sağlar tarafından NorCOMM 3 genom düzenleme gibi konsorsiyumlar tarafından sunulan "off-the-raf" gen-hedefli fare ES hücre klonlarının durumu ile fare genomuna sokulur. Nükleaz aracılı mutasyonlar taşıyan Kurucu hayvanların her zaman ES hücrelerinin enjeksiyonu blastosist kaynaklanan kimera için durum böyle değildir yüksek germ-hattı yetkili 4-6,20,21, görünmektedir. Bu nedenle, bazı durumlarda des mikroenjeksiyon inigner nükleazlar hedef genom modifikasyonlarla yeni fare hatları önemli ölçüde daha hızlı üretimi ile sonuçlanabilir.
ZFN ve yetenekleri yeri püskürtülmesiyle knockout farelerde başarılı bir şekilde üretimi enjekte nükleaz çiftinin aktivitesi üzerinde büyük ölçüde bağlıdır. TALENS organizma bir dizi gen geniş bir hedef yüksek başarı oranına sahip olduğu gösterilmiştir; Bununla birlikte, son çalışmalar TALEN bağlayıcı sitozin metilasyon 30,31 duyarlı olduğunu göstermektedir. Böylece, yeni üretilen nükleaz çiftleri, örneğin TALENS pCAG-T7 vektörlerine klonlanır, örneğin NIH-3T3 veya Nöro gibi bir fare hücre hattı içine geçici olarak transfekte edilebilir bir ölçüde fare embriyo kromatin durumunu taklit-2a. Burada, nükleaz aktivitesi önceden mRNA sentezi ve mikroenjeksiyon bölüm 5'de tarif edildiği gibi T7 endonükleaz analizi ya da PCR ürünü bir sınırlama sindirimi kullanan tahmin edilebilir. Bu bağlamda ilgili genomik bölgenin sıralama tavsiyehücre çizgisi ve mikro-enjeksiyon deneyleri için kullanılan fare suşu ive.
Fare zigot, farklı TALEN veya ZFN çiftleri farklı mRNA konsantrasyonlarda en iyi şekilde çalışır ve bu nedenle mikro-enjekte nükleaz mRNA'nın en uygun çalışma konsantrasyonu deneysel olarak tespit edilmesi gerekebilir. Çok yüksek embriyo ölümcül neden olabilir, oysa nükleaz çift bağlı olarak, çok düşük bir konsantrasyonunun bir yarılmaya neden olur. Nukleaz çifti bağlı olarak, 2 ng / ul ve 200 mikrogram / ul gibi yüksek kadar düşük toplam mRNA konsantrasyonları kullanarak başarı oldu. Bu etkiler, hücre kültürü ve embriyo hayatta kalma ve hedef lokusunun modifikasyonu oranı her iki deneysel olarak tespit edilmesi gerekmektedir için optimum konsantrasyon nükleaz deney tahmin etmek güçtür.
Yüksek aktif ZFN veya TALEN mikroenjeksiyon embriyo tek hücreli aşamada ötesinde hedef sekansı ayrılması ve bu nedenle mutagenez An karmaşık kalıpları neden olabilirkurucuları d mozaisizm. Biz ve diğerleri 4, tek bir kurucu (Şekil 5C) üç veya daha fazla farklı mutasyona uğramış allelleri gözlemledik. Bu kurucuları yeni bir fare hattı kurulması Böylece, yavrular dikkatle sindirim deneyler, tanımlanmamış bir mutasyon mevcut tek olduğunu kanıtlar sağlarlar uygun mutasyonun varlığı için sıralanmasıyla taranmalıdır.
Eleştirilerden biri sık sık ZFN ve TALEN sistemlerine karşı dile getirdiği bu nükleazlar da hedef sitelere benzer genomunda başka bir yerde mevcut dizilerini klivajlayabilen olasılığıdır. Bu gibi hedef dışı etkiler homodimerik Fokl alanı kullanarak erken üretimi reaktifleri ile gözlenmiştir ve heterodimer konstruktları hedef dışı etkiler 25 hafifletmek için dizayn edilmiştir. Olası hedef dışı siteleri silico 32,33 bir dereceye kadar öngörülen ve PCR ve dizileme ile taranabilir. Bariz bir avantaj of yerine hücre çizgileri daha farelerin üretilmesi için ZFNs ve TALENS kullanan tercih edilen bir vahşi tip suşu için çeşitli çaprazlamaların gerçekleştirerek arzu edilen genom modifikasyona bağlanmamış hedef mutasyonları kapalı kaldırma olasılığıdır. Kurucu farelerin çok sayıda, nükleaz hedefli lokusundan üretilir ve siliko hedef dışı tahmin edilen PCR ürünlerinin nesil derin sekanslama analizi için noktalar, PCR ürünlerinin sindirim deneyleri için alternatif bir nicel ve nitel okuma sunabilir.
Bu protokol açıklanan yardımla üreme teknikleri gibi C57Bl/6J veya B6D2F1 gibi mikroenjeksiyon deneyleri için kullanılan standart fare suşları için optimize edilmiştir. Bu tür suşlar outbred gibi farklı orijinlerden Fareler, prensip olarak genom düzenleme yaklaşımlar için kullanılabilir ve özel araştırma soru için daha uygun bir genetik arka planı sağlayabilir. Böyle süperovülasyon gibi yardımla üreme tekniklerinin performansı predi olabilirsuşları 34-36 bir dizi cted ama nükleaz mikroenjeksiyon için embriyo yeterli sayıda elde etmek için standart olmayan suşlar için daha fazla optimizasyon gerektirebilir.
ZFN ve Yeten yanı sıra, bu tür RNA-güdümlü CRISPR/Cas9 sistemi 9,37,38 gibi yeni tasarımcı nükleazlar şimdi genom düzenleme uygulamaları için getirilmiştir. Mikroenjeksiyon ve burada tarif edilen kurucu hayvan analiz için tüm yöntemler de CRISPR/Cas9 ve genom düzenleme gelecek modları için de geçerlidir.
The authors have nothing to disclose.
Biz mükemmel teknik yardım için Monika Tarnowska, Cornelia Albrecht, ve Ewa Skoczylas teşekkür etmek istiyorum. Bu çalışma SNF Sinergia hibe CRSI33-125073 PP tarafından finanse edildi.
BsaI | NEB | R0535S or L |
Esp3I | Thermo Scientific | ER0451 |
T4 Ligase | NEB | M0202S or L |
Spectinomycin | Sigma | S0692-1ML |
Ampicillin | Sigma | A0166 |
X-Gal | Sigma | B4252 |
IPTG | Sigma | I6758 |
Plasmid-Safe nuclease | Epicentre | E3101K |
QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27106 |
QIAGEN Plasmid Midi Kit | Qiagen | 12143 |
QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28106 |
mMESSAGE mMACHINE T7 Ultra Kit | Invitrogen | AM1345 |
NucAway Spin Columns | Invitrogen | AM10070 |
RNaseZAP | Sigma | R2020-250ML |
NorthernMax Formaldyde Load Dye | Invitrogen | AM8552 |
RNA Millennium Markers | Invitrogen | AM7150 |
10x TBE buffer | Thermo Scientific | B52 |
T7 endonuclease | NEB | M0302S or L |
pGEM-T EasyVector System I | Promega | A3600 |
SYBR Green I Nucleic Acid Gel Stain | Invitrogen | S-7563 |
pregnant mare's serum gonadotrophin (PMSG) | Sigma | G4877 |
human chorionic gonadotropin (hCG) | Sigma | CG5 |
M2 embryo culture medium | Sigma | M7167 |
M16 embryo culture medium | Sigma | M7292 |
Mineral oil, embryo tested | Sigma | M8410 |
Ketamine | CentraVet | Ket 201 |
Xylazine | Sigma Aldrich | 46995 |
Equipment/Tools | ||
Inverted microscope with Nomarski DIC optics (for example Nikon Eclipse TE200) | Nikon | |
Micromanipulator units (for example Narishige, NT88NF) | Narishige | |
Embryo holding capillaries | Sutter instruments | B100-75-10 |
Embryo injection capillaries | Narishige | GD-1 |
Capillary puller (for example Sutter P97) | Sutter instruments | |
Microforge (for example Narishige MF-900) | Narishige | |
Walton skin scissors | FST | 14077-10 |
Surgical scissors | FST | 14041-10 |
Surgical probe | FST | 10140-03 |
Reflex wound clip system (9mm) | FST | 12031-09 |
Reflex wound clips (9mm) | FST | 12032-09 |
Dumont fine forceps 5 | FST | 11254-20 |
Moria curvrd forceps | FST | 11370-31 |
Moria fine forceps | FST | 11399-80 |
Dietrich bulldog clamp | FST | 18038-45 |
Animals | ||
C57BL/6J mice | Jackson labs | strain code 000664 |
CD-1 mice | Charles river | strain code 000664 |