Contextuales y complementada el condicionamiento del miedo de prueba utilizando un sistema de análisis de vídeo en ratones

Todos los experimentos deben realizarse de acuerdo con la orientación y los protocolos establecidos por los Comités de Cuidado de Animales y el empleo locales. 1. Aparato Marco El aparato para la prueba de acondicionado y el contexto es una cámara cuadrada con un suelo de rejilla electrificable, una fuente de sonido, y un generador de choque calibrado. Se utilizan varios tamaños de la cámara, con dimensiones que varían de 54 cm x 27 cm x 30 cm de 21 a 25 cm x 35 cm x 30 cm 22. En este protocolo, el aparato consiste en una cámara cuadrada de acrílico (33 cm x 25 cm x 28 cm; transparente en las paredes delantera y trasera, de color blanco en las paredes laterales) con rejillas de metal (0,2 cm de diámetro, espaciados 0,5 cm de separación) cubiertos por una tapa de acrílico transparente (Figura 1A). Es necesario colocar la cámara en un piso de acrílico blanco (Figura 1B) para analizar el comportamiento de los ratones marrón negro, agutí o diluir, ya que un sistema de análisis de imagen con el queprograma mageFZ software (disponible para su descarga gratuita, consulte la Tabla de materiales / reactivos) que distingue a un sujeto oscuro de un fondo blanco de cada imagen de vídeo capturado en. Ratones albinos también se pueden probar usando rejillas de metal negro y un piso de acrílico negro (Figura 1B). Diodo emisor de luz (LED) se unen al techo por encima del aparato. El suelo de rejilla se ilumina a 100 lux por las luces LED. Un altavoz conectado a un generador de ruido blanco / tono (Figura 1C) se monta en un techo 5 cm por encima de la tapa para presentar una señal auditiva (un ruido blanco, 55 dB) como un estímulo condicionado (CS). Las rejillas están conectados a un generador de descargas (Figura 1C) para entregar un choque eléctrico eléctrico como el estímulo incondicionado (EE.UU.). La cámara de ensayo se coloca en una habitación a prueba de sonido (170 cm x 210 cm x 200 cm) (Figura 1D) para minimizar el ruido externo durante las pruebas. Esta condición también evita que los ratones a los que actualmente no están siendo sometidos a unprobar de escuchar una señal auditiva o la vocalización de los ratones de prueba. El aparato para la prueba de cued se compone de una cámara que tiene propiedades diferentes de la cámara de acondicionamiento, proporcionando un nuevo contexto. Es imperativo para cambiar las señales sensoriales tanto como sea posible de modo que el ratón percibe la novela contexto como no relacionada con la cámara de acondicionamiento. En general, se utiliza una caja en forma diferente o una cámara triangular. Además, diferentes de iluminación y / o señales olfativas también se proporcionan al ratón. En este protocolo, el aparato es una cámara triangular de acrílico (33 cm x 29 cm x 32 cm; blancas en cada pared lateral) con un piso plano de color blanco para los ratones marrón negro, agutí o diluir o un piso negro piso en albino ratones, cubierto con una tapa de acrílico transparente (Figura 1E). Luces LED están unidos al techo por encima del aparato. El nivel de iluminación de la pista se ha fijado en 30 lux. Un altavoz está montado en el techo 5 cm por encima de la tapa para prESENT una señal auditiva que es la misma que se proporciona a los ratones en el momento de acondicionado. La cámara triangular se encuentra en una sala insonorizada diferente de la habitación en la que se llevan a cabo el acondicionamiento y la prueba de contexto. Cada cámara está equipada con una carga montada en el techo Coupled Device (CCD) se conecta a un ordenador con Windows a través de cuatro divisor de vídeo y USB dispositivo de captura de imágenes para monitorear el comportamiento del ratón, y las imágenes de los aparatos y el ratón son capturados y analizados por el programa de software de aplicación ImageFZ (ver Protocolo 6). Los generadores de ruido blanco y descarga en las patas son controlados automáticamente por el programa de software ImageFZ, la hora de inicio y la duración del ruido blanco y descarga en las patas deben estar escritos en un archivo de texto (ver un archivo de texto de ejemplo "simple-aire 'se muestra en el video de la detalles sobre cómo los parámetros se escriben en el archivo), que se lee en la aplicación. Antes de cada prueba se inicia, las paredes de acrílicoy pisos se limpian con una toalla empapada en agua hipocloroso super (pH 6-7), y las rejillas se limpiaron con etanol al 70% para evitar un sesgo basado en señales olfativas. Las rejillas se limpiaron con etanol en vez de agua hipocloroso súper para asegurar que las rejillas no disminuyen su conductividad eléctrica debido a la oxidación. 2. Preparación de los animales Por lo general, de dos a cuatro ratones son alojados por jaula en una sala de espera con temperatura controlada (23 ± 2 ° C) con un 12 hr luz / oscuridad ciclo (por ejemplo, luces encendidas a las 7:00 AM). En este protocolo, para reducir las posibles influencias de transporte jaula en el comportamiento y para adaptar los ratones para el medio ambiente experimental, las jaulas que contienen los ratones se transfieren desde el local de confinamiento en una sala de espera a prueba de sonido adyacente a una sala de pruebas a prueba de sonido, al menos, 30 min antes del comienzo de cada prueba. Todos los experimentos (Figura 2A) se debe realizar durante los speríodo de tiempo ame a la luz o la fase oscura de cada día para minimizar las variaciones de comportamiento obtenidos de ensayos realizados en diferentes momentos 23,24. En este protocolo, todos los experimentos se llevan a cabo entre 1 hora después del inicio de la fase de luz y 1 hora antes del inicio de la fase de oscuridad (8:00 AM a 6:00 PM en la fase de la luz). Si sólo hay un aparato está disponible, los ratones de cada genotipo se deben probar en un orden alternado para reducir los efectos potenciales del tiempo experimental y el orden de las pruebas de los sujetos en el rendimiento conductual. ImageFZ puede controlar un máximo de 4 aparatos. Prueba de 4 ratones al mismo tiempo mediante el uso de 4 aparatos en un orden alternado permite al investigador para ahorrar tiempo y reduce los posibles efectos de los parámetros experimentales sobre el comportamiento del ratón. 3. Acondicionamiento Los ratones se colocan en la cámara de acondicionamiento, y los ratones son típicamente les permite explorar libremente la cámara para 120 seg. A partir de entonces, la aucue ditory, como un ruido blanco, el tono y clicker auditivo, se presenta como un CS durante 30 segundos, y una descarga en las patas 0,1-0,8 mA es dada a los ratones como los EE.UU. durante los últimos 2 segundos del sonido. La presentación del pelado EC-EI se repite para fortalecer la asociación. Los ratones se dejaron en la cámara durante un período de tiempo después de la última presentación para establecer aún más la asociación entre el contexto de la cámara y la experiencia aversiva. En este protocolo, después de 120 segundos de la exploración libre, una señal auditiva (ruido blanco, 55 dB) se presenta durante 30 segundos, y una descarga en las patas 0,3 mA se entrega de forma continua durante los últimos 2 segundos del ruido blanco. Después de 90 segundos, la pareja formada por la señal auditiva con la descarga en las patas se le da a los temas de nuevo. La presentación de CS-US repite tres veces por sesión (120, 240, y 360 segundos después del comienzo de la acondicionado) (Figura 2B). Después de la descarga en las patas final, los ratones se dejan reposar en las cámaras para 90 seg. Antes de que comience la sesión de acondicionamiento, ejecute el programa de software de aplicación ImageFZ, seleccione el menú de plug-in 'FZ FZ acondicionado y línea (4 cámaras)', y establecer los valores de los parámetros paso a paso de la siguiente manera. Paso 1: Identificación de Proyectos. Especifique la carpeta donde desea almacenar los archivos de datos. Paso 2: Nombre de la sesión. Escriba cualquier palabra, por ejemplo, la fecha experimental, en la caja 'Sesión' y seleccione un archivo de texto de referencia en el que el tiempo de inicio y la duración del ruido blanco y descarga en las patas se escriben, en la caja 'Referencia'. Un archivo de texto de ejemplo se muestra en el video. Paso 3: Configuración de parámetros. Introduzca los valores de los parámetros en cada cuadro de la siguiente manera. Tarifa (cuadros / s): velocidad de cuadro de adquisición de imágenes, por ejemplo, 1 cuadro / seg. Duración (seg): en el caso de acondicionamiento, la duración total es de 480 seg. Duración Bin (seg): por ejemplo, 60 seg; Los datos se analizan en cada bloquede 60 seg. Tamaño Asunto – min (píxeles): ImageFZ detecta un ratón y el ruido como las partículas de negro (algunas masas de píxeles) en un fondo blanco en cada imagen. Cuando el área de la partícula de negro (píxeles) es menor que el "tamaño de Asunto – min (píxeles) 'valor (por ejemplo, 100 píxeles), las partículas se consideran como ruido y se excluyen del análisis de imagen. Asunto tamaño – max (píxeles): cuando los tamaños de las partículas negras son más que el tamaño del "tamaño Asunto – max (pixels)« valor, las partículas quedan excluidos del análisis. Tamaño de caja – ancho / altura (cm): dimensión de la cámara, es decir, 33 cm de ancho y 25 cm de alto. Congelación criterio (píxeles): por ejemplo, 30 píxeles, vea los detalles en el Protocolo 6. Congelación duración – min (seg): por ejemplo, 2 segundos, y cuando no se detecta ningún movimiento del ratón por sólo menos de 2 segundos, su comportamiento no se cuenta como "congelamiento";. Tasa Shock (cuadros / s): ver los detalles en el Protocolo 6. Paso 4: Tema ID. Introduzca la identificación del sujeto. Paso 5: Configuración de la cámara. Permite controlar el brillo y el contraste de la imagen capturada. Paso 6: Configuraciones de umbral. Ajuste los valores de umbral para detectar un ratón negro en forma de píxeles negros en un fondo blanco en cada imagen y para juzgar el comportamiento del ratón como "congelación" o "no-congelación" (ver los detalles en el Protocolo n º 6). Para analizar un ratón albino, haga clic en la casilla 'modo de inversión', y ajustar los valores de umbral adecuadamente. Paso 7: Configurar la jaula de campo. Especifique el campo de cada cámara que desea capturar. Después de hacer clic en el botón de rectángulo en la caja de herramientas, dibujar un rectángulo alrededor del piso de la cámara en la ventana de la imagen en vivo. A continuación, seleccione el número de cámara y haga clic en el botón 'Set'. Por último, haga clic en el botón ''. <li> Después de los ajustes de los parámetros se establecen, una prueba preparatoria debe administrarse utilizando ratones de práctica (ratones no utilizados como sujetos) antes de la primera prueba del día para determinar si el sistema de análisis de imagen y blancas generadores de ruido / choque funcionan sin problemas. Mover una jaula que contiene los ratones de la práctica a la sala de ensayo insonorizada de la sala de espera adyacente, y coloque cada ratón en la cámara de acondicionamiento. Inmediatamente después de la colocación de los ratones de la cámara, haga clic en el botón de inicio de ImageFZ. El software de aplicación se presentarán señales auditivas y / o estímulo eléctrico plantar eléctricas a los ratones en el orden que se especifica en un archivo de referencia. Una vez transcurrido 480 segundos, volver a los ratones a su jaula y volver a la jaula para la plataforma en la sala de espera. Limpie las cámaras con cuidado. A continuación, haga clic en el botón "Análisis Next ', y repita los pasos 3.2.4-3.6 para los ratones de prueba. Tiendas ImageFZ viven y trazar imágenes en formato TIFF. El programa permite a losnos permiten realizar un análisis fuera de línea para volver a analizar las imágenes utilizando los valores de parámetros modificados. Si usted realiza un análisis fuera de línea, seleccione el plug-in del menú 'Fear acondicionado y FZ Desconectado "y seleccione la carpeta de datos que desea volver a analizar. A partir de entonces, de entrada los valores de los parámetros de nuevo y haga clic en el botón ''. 4. Prueba Contexto Después de la sesión de condicionamiento se ha completado, los ratones se devuelven a la misma cámara de acondicionamiento y marcados para la congelación de comportamiento para medir el miedo contextual acondicionado (prueba de contexto). Un intervalo de retardo entre el acondicionado y la prueba de contexto se ha establecido en general, a las 24 h. En este protocolo, para evaluar la memoria reciente y la memoria remota (medido por el test de 1 día y más de 28 días después del acondicionamiento, respectivamente) 25, los ratones se sometieron a la prueba de contexto, aproximadamente 24 horas y 30 días después de la sesión de condicionamiento. Los ratones se colocan en la conditioning cámara y se les permite explorar libremente la cámara durante 300 segundos y sin EC y el EI presentaciones (Figura 2C). Ejecute el programa de software ImageFZ y establecer los valores de los parámetros del software de aplicación de la misma manera que en el condicionamiento (véase la sección 3.2.3), sin embargo, modificar el tiempo de duración de esta prueba a 300 segundos y seleccione un archivo de texto de referencia para la prueba de contexto . Después de cambiar la configuración, una prueba preparatoria debe administrarse utilizando ratones de práctica para comprobar el sistema ImageFZ. Coloque cada ratón en la cámara de acondicionamiento y haga clic en el botón de inicio. Una vez transcurrido 300 segundos, devolver los ratones en su jaula, y dejar la jaula en reposo hasta que comience la prueba con claves. Limpie las cámaras. A continuación, haga clic en el botón "Análisis Next ', y repita los pasos 4.3 hasta 4.4 en los ratones de prueba. 5. Prueba con claves Prueba con claves se lleva a cabo en el mismo día de la prueba de contexto o en el día siguiente.En esta prueba, los ratones se colocan en otra cámara de pruebas con propiedades muy diferentes, proporcionando un nuevo contexto que no está relacionada con la cámara de acondicionamiento durante 3 min. Al final de la primera 3 min, la señal auditiva que se presenta en el momento de acondicionado se da a los ratones durante 3 min en la novela entorno de contexto. En este protocolo, se realiza la prueba con claves de unas pocas horas después de la prueba de contexto. Los ratones se les permite explorar la cámara triangular para 360 seg. En los primeros 3 minutos, ni un CS ni EE.UU. se presenta, ya partir de entonces, un CS (a 55 dB de ruido blanco) se presenta para la última 3 min. Ejecutar el programa de software ImageFZ y establecer los valores de los parámetros de la misma manera como en el acondicionamiento, excepto modificar el tiempo de duración de la prueba a 360 seg y seleccione un archivo de texto de referencia para la prueba con claves. Después de ajustar la configuración, una prueba preparatoria debe administrarse utilizando ratones de práctica para comprobar el sistema ImageFZ. Coloque cada ratón en la cámara de forma triangular y haga clic en el iniciobotón. Una vez transcurrido 360 segundos, volver a los ratones a su jaula y devuelva la caja al estante de la sala de espera. Limpie las cámaras. A continuación, haga clic en el botón "Análisis Siguiente" y repita los pasos 5.3 a 5.4 en los ratones de prueba. A fin de probar la memoria remota, repita los Protocolos 4-5 alrededor de 30 días después de la sesión de condicionamiento (Figura 2A). 6. Análisis de Imagen Lleve a cabo la adquisición y análisis de datos de forma automática utilizando ImageFZ. Este programa de software de aplicación se basa en el programa de dominio público ImageJ (desarrollado por Wayne Rasband en los Institutos Nacionales de Salud y disponible en http://rsb.info.nih.gov/ij/), modificado por Tsuyoshi Miyakawa (software de aplicación ImageFZ , disponible para su descarga gratuita, ver Tabla de materiales / reactivos). Para todos los experimentos, la captura de imágenes a una velocidad dada marco (por ejemplo, 1 fps) con ImageFZ usando un dispositivo de captura de vídeo USB, incluyendo uncámara de vídeo. Para medir la distancia recorrida a partir de las imágenes consecutivas, ajustar el valor del programa (por ejemplo, 80 píxeles), que se fija al segmento de las imágenes en una partícula negro (un ratón) y un fondo blanco los 'umbrales min. La distancia recorrida se calcula a partir de la distancia entre cada conjunto de las coordenadas XY para el centro de gravedad de la partícula en las imágenes consecutivas. Para medir el comportamiento de la congelación de las imágenes consecutivas, ajuste el "umbral min (xor)« valor del programa (por ejemplo, 160 píxeles), que se fija al segmento de las imágenes en una partícula negro (ratón) y el fondo, y luego calcular la cantidad de área (pixeles) de las regiones no superpuestas entre las partículas de cada par de imágenes consecutivas. Ajuste el valor con el control deslizante de la herramienta umbral hasta que la partícula de negro en cada imagen coincide con la forma de todo el cuerpo del ratón sin incluir la cola. Si el área de la nonoverlapping región está por debajo del valor "criterio de congelación '(por ejemplo, 30 píxeles), el comportamiento es considerado como" congelamiento "(Figura 3), que generalmente se define como la ausencia total de cualquier movimiento, excepto para la respiración y el ritmo cardíaco. Cuando el área excede este valor, el comportamiento se considera que es "no-congelación '(Figura 3). El juicio debe hacerse con base en la definición de la congelación. Los ratones a veces exhiben un movimiento sutil y una inmovilidad momentánea, lo que no podría considerarse como un comportamiento de congelación que refleja el miedo. La inmovilidad que dura por un corto tiempo (por ejemplo, menos de 2 segundos), que es probablemente diferente de la manifestación del miedo, puede ser excluido del análisis estableciendo el umbral de tiempo de congelación. Para establecer el umbral de tiempo, entrada de 'congelación duración – min (segundos)' valor (por ejemplo, 2 segundos). El programa ImageFZ automáticamente calculAtes la distancia recorrida (cm) y el porcentaje de congelación. Los resultados se guardan en archivos de texto, y viven y se trazan las imágenes se almacenan en formato TIFF. Para medir la distancia recorrida (cm) como un índice de sensibilidad descarga en las patas eléctrica, el programa ImageFZ también adquiere imágenes a una alta velocidad de cuadro (por ejemplo, 4 fps) durante 6 s, medida a partir de 2 segundos antes de la entrega de una descarga en las patas 2 seg hasta 2 segundos después de choque eléctrico durante el análisis en línea. Para establecer la velocidad de fotogramas para la captura de imágenes, antes, durante y después de la descarga en las patas, la entrada de un valor en el «índice de Shock (cuadros / seg) 'caja. Tras el análisis en línea, realizar análisis fuera de línea seleccionando un plug-in del menú 'FZ Choque sin conexión' para obtener los datos de la distancia recorrida. Los valores de los parámetros del programa ImageFZ deben ser optimizados para generar resultados similares a los obtenidos por los observadores humanos en las pruebas preparatorias. Para la puntuación manual, el comportamiento de la congelación se mide continuamente mediante un stopwatch y un programa de eventos de grabación o un procedimiento de muestreo de tiempo instantáneo cada 3-10 segundos, durante el análisis utilizando el software ImageFZ. Dos observadores típicamente llevan a cabo la observación del comportamiento. Para ajustar los valores de los parámetros del programa ImageFZ para asegurar que los resultados del análisis de imágenes son compatibles con los de los observadores humanos, realizar un análisis en línea del programa ImageFZ, modificando el "umbral min (xor) 'y valores" criterio congelación' . Para realizar el análisis fuera de línea, seleccione el menú de plug-in 'FZ sin conexión "y la entrada de los valores de los parámetros. 7. Solución de problemas ¿Cómo se puede obtener el programa ImageFZ e instalado? El programa ImageFZ está disponible para su descarga gratuita desde nuestro sitio web (véase la Tabla de materiales / reactivos), y se ejecuta en un equipo con Windows. Descargar la carpeta zip para ImageFZ e instalar el software en su ordenador. Consulte el archivo "readme.txt" para la INSTALACIÓNen los detalles y siga las instrucciones paso a paso. ¿Por qué aparece el mensaje de error "dispositivo de captura de ajuste de error '? Compruebe la conexión del cable de la cámara y de la instalación del controlador del dispositivo de captura de imágenes USB. Si no hay ningún problema con la configuración, el software ImageFZ no podría funcionar con el dispositivo de captura de imágenes. Consulte el archivo "readme.txt" en relación con el dispositivo adecuado para usar con el software ImageFZ. ImageFZ no puede detectar la totalidad del cuerpo del ratón como una partícula. Establezca el valor de "umbral min 'y / o' umbral min (xor) 'menor que el valor actual. Si ImageFZ no detecta el ratón en un lugar específico, por ejemplo, la esquina de una cámara de prueba y, a continuación, podrían existir condiciones de prueba suficientes, como un piso uniformemente iluminado o una diferencia de poco contraste entre el ratón y el fondo. Para resolver este problema, ajustar los valores de los parámetros (por ejemplo, </em> brillo y el contraste de los valores de la imagen y de umbral en vivo) de ImageFZ, controlar el número y la posición de las luces, o utilizar un fondo blanco por un ratón negro. Captura de imagen a una velocidad alta se ralentiza el ordenador durante el análisis en línea. Ajuste la velocidad de fotogramas a un valor inferior a la tasa actual, y realizar análisis en línea. El análisis ImageFZ, a través de adquisición de la imagen en 1 fps, es suficiente para medir con precisión la congelación, como se muestra en la sección de resultados representativo. Los resultados del análisis ImageFZ no están de acuerdo con los de puntuación humano. Examine la imagen almacenada y archivos de resultados del juicio. Si ImageFZ sobreestima la congelación, establezca el 'criterio de congelación »a un valor menor que el valor actual, y realizar análisis fuera de línea. Si ImageFZ subestima congelación, establezca el "criterio congelamiento" a un valor superior al valor actual. En optogenetical y vivo electrofisiológica e enxperimentos, el cable de fibra adherida a la cabeza del ratón interfiere con el juicio de la congelación. Escudo de los cables en blanco para un ratón negro y cambiar la posición y el ángulo de la cámara hasta que no se detectan los cables. ¿Qué se necesita para el análisis fuera de línea? Cree una carpeta denominada 'Image_FZ' en el directorio raíz del programa ImageFZ. En esta carpeta, cree las subcarpetas 'Imágenes' y 'Sesiones'. Mover una imagen en escala de grises de 8 bits a la carpeta "Imágenes", y crear un archivo de texto en el que el nombre de archivo de la imagen se escribe en la carpeta 'Sesiones'. A partir de entonces, ejecutar el análisis offline ImageFZ, y siga las instrucciones del programa.