Анализ in vitro для оценки влияния иммунорегуляторных Пути на ВИЧ-специфических CD4 Т-клеток эффекторной функцией

Во стойких вирусных инфекций, вирусов конкретных-Т-клетки приобретают функциональные дефекты в процессе, известном как Т-клеток истощения. В начале естественных условиях исследования в мышиной LCMV модели хроническим вирусным инфекции установлено, что измученные вирус-специфических Т-клеток сократили цитолитическую функцию против инфицированных вирусом клеток, теряют способность к пролиферации и сократили способность производить цитокины, такие как IL-2, TNF- α и ИФН-γ ^1,2. Сложная сеть иммунорегуляторных путей, таких как PD-1 и IL-10, которые активируется во время хронических инфекций и способствуют T дисфункции клеток (обзор в ^3,4). В естественных введения блокирующих антител против этих ингибирующих путей в LCMV мыши модель восстановлен функцию истощенных вирус-специфических Т-клеток и повышенную вирусной зазор, указывая, что истощение Т-клеток представляет собой частично обратимый феномен (обзор в ^5).

Выводы по гоэ LCMV модель быстро распространяется на человека хронических вирусных инфекций, таких как ВГВ, ВГС и ВИЧ ^5. При хроническом инфекции ВИЧ-1, ПД-1 и IL-10 Тропы активируется в инфицированных субъектов и коррелируют с параметрами прогрессирования заболевания, непосредственно с вирусной нагрузки и обратно с CD4, ^6-8. Антитело блокада PD-1 или IL-10 пролиферации путей в пробирке восстановлен ВИЧ-специфических CD4 и CD8 Т-клеток, указывающих, что, подобно модели LCMV мыши, истощение Т-клеток у человека является частично обратимым явлением. Однако, в связи с деликатным характером экспериментов на образцах человека, а также ограничений в чувствительности анализов в лабораторных условиях, тщательного расследования функциональных профилей реставрационных достичь за счет этих мер поразительно отсутствует. Пролиферации анализы были, до сих пор, единственным надежным анализа в пробирке испытания в большинстве исследований, но есть замечательный отсутствие доказательств о влиянии этих Интерконвенций на: 1) убийство мощностью цитотоксических Т-клеток, 2) противовирусное действие Т-клеток на вирусную репликацию, 3) профиль секреции цитокинов и 4) воздействие на CD4 Т-клеток на других подмножеств клеток.

Внутриклеточное окрашивание цитокинов (ICS) является очень полезным и широко используется проточной цитометрии на основе анализа, который используется для обнаружения продукцию цитокинов в клетках различных типов в обоих мышей и человека. Кроме того, было исследовано влияние антител блокады ингибирующих путей. В ICS анализов, секрецию цитокинов блокируется путем добавления брефельдин и / или монензин. Цитокины ловушке внутри клеток затем обнаружены с флуоресцентными антителами на полихроматическое проточной цитометрии. Продолжительность анализа обычно ограничивается 6 или 12 ч после антигенной стимуляции, так как оба брефелдин и Монензин, который обычно добавляют в течение 2 часов антиген того, являются токсичными к клеткам. ICS анализ является мощная техника, которая была полезна ян исследование влияния в естественных условиях введения блокировки вмешательства антител у мышей, где клетки были извлечены после определенного периода времени после воздействия антител ^9. Тем не менее, есть несколько ограничений для применения этого экспериментального подхода для оценки влияния блокады ингибирующих рецепторов в образцах человека. При выполнении антител вмешательства ингибирующих путей в час стимуляции 6 или 12 в пробирке (обычно в случае с образцами человека), блокада ингибирующих рецепторы в большинстве случаев не изменяет частоту реагирования антиген-специфические Т-клетки, как измерить стандартными ICS анализов ^{6, 7.} Измерения продукции в ячейке цитокинов по результатам теста средней или средней интенсивности флуоресценции дали противоречивые результаты ^{6, 7, 10.} С другой стороны, когда ICS проводят при поздно момент времени после стимуляции (то есть шесть дней), изменения количества цитокинов, секретирующих слоктей можно наблюдать. Различия Совокупный эффект измененного пролиферации, выживания, и изменения в эффекторной функции, которые накапливаются в течение определенного периода времени ^6. Один из способов частично преодолеть эти ограничения, чтобы инкубировать в течение более длительных периодов времени (например, 36 ч, 60 ч, и т.д..) С антигеном перед добавлением секреции цитокинов блокатор, не дожидаясь распространение произойти. Мы успешно использовали этот метод для определения кинетики секреции цитокинов ВИЧ-специфических CD4 и CD8 Т-клеток ^11,12, однако, такой подход не в состоянии обнаружить небольшие ответов и не даст комплексный результат общая секреция цитокинов происходит так стимуляции. Таким образом, ICS не достаточно чувствительный метод для обнаружения воздействия блокады ингибирующих путей на количество цитокинов, продуцируемых активированными Т-клетками по сравнению с мРНК цитокинов количественного измерения или секреции цитокинов в supernatanт в тех же точках времени. Кроме того, большинство из цитокинов, продуцируемых активированными Т-клетками действовать в аутокринного моды, внося вклад в положительный или отрицательный обратной связи через взаимодействие с антиген-представляющих клеток. Таким образом, добавление брефельдин или монензин в ICS тесте предотвращает секрецию цитокинов и, таким образом, стимуляция Т-клеток не является оптимальным. Наконец, обнаружение нескольких цитокинов с ICS ограничена доступностью и чувствительностью антител для детекции цитокинов с проточной цитометрии, а также из-за ограниченности в количестве флуорохромов, которые могут быть использованы одновременно в любом данном панели.

Мы разработали высокочувствительный в пробирке экспериментальный подход для оценки воздействия иммунорегуляторных путей в регуляции секреции цитокинов ВИЧ-специфических CD4 Т-клеток, а затем CD4 помощь антиген представляющих клеток (АПК) и естественных клеток-киллеров (NK-клетки). Этот метод также может быть использован для оценки ИТПМКТ блокады ингибирующих молекул на функции CD8 Т-клеток, разрушая лимфоциты CD4 от МНПК или путем стимулирования с оптимальными пептидов, которые признаны только CD8 Т-клеток. В отличие от внутриклеточного окрашивания цитокинов анализов, мы решили, чтобы не мешать секреции цитокинов ВИЧ-специфических Т-клеток CD4 для того, чтобы иметь возможность: 1) выполнить более точное количественное определение уровней цитокинов, производимых; 2) исследовать более широкий панель цитокинов или эффекторных молекул, и 3) оценить влияние цитокинов, произведенных ВИЧ-специфических CD4 Т-клеток на других подмножеств клеток. Мы стимулируют CD8 истощенных РВМС с ВИЧ-1 Gag пула пептидов в присутствии блокирующих антител для иммунорегуляторного пути интереса. По истечении заданного времени инкубации, обычно 48 часов, мы собираем супернатанты для измерения секрецию цитокинов с массивами бортовых и собирать ячейки гранул либо для фенотипического анализа различных подмножеств клеток или для транскрипции анализа. Следует отметить, что при Тего 48 раз час точка, мы не обнаружить значительное население пролиферирующих Т-клеток ^12. Это гибкий подход и несколько адаптации этой конструкции могут быть применены для решения различных гипотез. Например, отдельные подмножества клеток (например, ВИЧ-специфических Т-клеток CD4 или PD-1 высоких CD4 Т-клеток и т.д.). Могут быть отсортированы после 12 ч инкубации до дальнейшей инкубации в течение 36 ч с последующим сбором и супернатантах клеточных осадков исследовать более конкретно воздействие мероприятий блокады на секрецию цитокинов, определенных субпопуляций МНПК.