Calciumphosphat-Transfektion von primären Hippocampus-Neuronen
Summary
Calciumphosphat-Präzipitation ist eine bequeme und kostengünstige Methode zur Transfektion von kultivierten Zellen. Mit Optimierung ist es möglich, dieses Verfahren auf Fest transfizierbaren Zellen wie primäre Neuronen verwendet werden. Hier beschreiben wir unsere detaillierten Protokoll für die Calciumphosphat-Transfektion von Neuronen im Hippocampus mit Astroglia-Zellen kokultiviert.
Abstract
Calciumphosphat-Präzipitation ist eine bequeme und kostengünstige Methode zur Transfektion von kultivierten Zellen. Mit Optimierung ist es möglich, dieses Verfahren auf Fest transfizierbaren Zellen wie primäre Neuronen verwendet werden. Hier beschreiben wir unsere detaillierten Protokoll für die Calciumphosphat-Transfektion von Neuronen im Hippocampus mit Astroglia-Zellen kokultiviert.
Introduction
Primären Neuronen eine der schwierigsten Zelltypen zu transfizieren, wie sie sind postmitotischen und sind sehr empfindlich gegenüber Mikroumweltveränderungen. Es gibt vier häufigsten verwendeten Arten von Verfahren zur Expression von exogenen Genen und Kurzhaarnadel-RNAs (shRNAs) in diesen Zellen ein. Jeder hat seine eigenen Vorteile und Nachteile. Zum Beispiel wird in der Regel auf Elektroporation frisch isolierten Neuronen 2 durchgeführt, wie Zellen müssen in Küvetten für die Transfektion übertragen werden. Virus-Infektion kann in der Regel sehr hohen Wirkungsgrad erreichen, 3, ist aber arbeitsintensiv und riskant für die Betreiber. Viele Lipid-vermittelte Transfektion Reagenzien sind kommerziell erhältlich, mit unterschiedlichem Erfolg in Neuronen und verschiedene Ebenen der Zytotoxizität.
Calciumphosphat-Transfektion eine bequeme und kostengünstige Methode zur Einführung von Fremdgenen in Neuronen. Die Methode wurde zuerst verwendet, um Adenovirus-DNA in Säuger cel vorstellenls von Graham und van der Eb (1973) 4. Transfektion wurde durch Mischen von Calciumchlorid, die mit rekombinanten DNA in einem Phosphatpuffer durchgeführt. Dies ermöglicht die Bildung von DNA / Calciumphosphat-Präzipitate, die, wenn nach und nach auf eine Monoschicht von Zellen gesunken, sich an die Zelloberfläche werden durch Endozytose aufgenommen und schließlich in den Kern 5. Dieses Verfahren würde die Expression von Fremdgenen eingeführt in der Zielzelle führen. Typische Wirkungsgrade von Calciumphosphat-Transfektion Bereich zwischen 0,5-5% 6-8. Bei sorgfältiger Optimierung und konsistente Ausführung des experimentellen Protokolls ist es jedoch möglich, eine Transfektionseffizienz von nahezu 50% erreichen. Hier beschreiben wir unsere detaillierten Protokoll für die Calciumphosphat-Transfektion von primären Hippocampus-Neuronen, die mit Astroglia-Zellen in einem Sandwich-Format 9 kokultiviert werden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Es gibt mehrere wichtige Parameter, die sorgfältig für konsequent erfolgreiche Transfektionen 10,11 kontrolliert werden müssen. Der kritischste Parameter zur Calciumphosphat-Transfektion ist der pH-Wert von 2 x HBS, die in unseren Händen variiert üblicherweise zwischen 7,10 bis 7,15. Es wird empfohlen, drei Chargen von Titeln mit pH-Werten in 0,05-Schritten, um die Differenz zwischen den pH-Meter ausmachen. Alternativ stellt die Clontech Säugetier Transfektion Kit 2x HBS, die durchweg guten Wirkungsgrad…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wird von NIH NS065183 und Start-up-Fonds von der Rutgers Robert Wood Johnson Medical School unterstützt.
Materials
| Dumont #5 forceps | Fine Science Tools | 11251-20 | |
| Fine scissors | Fine Science Tools | 14090-09 | straight / sharp 8.5 cm |
| Vannas-Tubinger spring scissors | Fine Science Tools | 15008-08 | angled / sharp / 8.5 cm / 5 mm cutting edge |
| Standard pattern forceps | Fine Science Tools | 11000-16 | |
| Student surgical scissors | Fine Science Tools | 91401-14 | blunt / 14.5 cm |
| Spring scissors | Fine Science Tools | 15006-09 | angled to side / 9 cm / 10 mm cutting edge |
| Isoflurane | Webster Veterinary | 14043-225-06 | |
| Poly-L-lysine | Sigma | P2636 | |
| MEM | Sigma | M2279 | |
| 100 mM Sodium pyruvate | Sigma | S8636 | |
| Glucose | Sigma | G8270 | |
| 10x HBSS | Sigma | H4385 | |
| 1 M HEPES, pH 7.3 | Gibco/Invitrogen | 15630-080 | |
| GlutaMAX | Gibco/Invitrogen | 35050-061 | |
| Neurobasal Media | Gibco/Invitrogen | 21130-049 | |
| B27 Supplement (50x) | Gibco/Invitrogen | 17504-044 | |
| N2 Supplement | Gibco/Invitrogen | 17502-048 | |
| Ovalbumin | Sigma | A5503 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco/Invitrogen | 15070-063 | |
| 2.5% Trypsin | Gibco/Invitrogen | 15090-046 | |
| DNase I | Sigma | DN-25 | |
| Cytosine arabinoside | Calbiochem/EMD Millipore | 251010 | |
| Kynurenic acid | Sigma | K3375 |
References
- Karra, D., Dahm, R. Transfection techniques for neuronal cells. J. Neurosci. 30, 6171-6177 (2010).
- Zeitelhofer, M., et al. High-efficiency transfection of mammalian neurons via nucleofection. Nat. Protoc. 2, 1692-1704 (2007).
- Janas, J., Skowronski, J., Van Aelst, L. Lentiviral delivery of RNAi in hippocampal neurons. Method Enzymol. 406, 593-605 (2006).
- Graham, F. L., vander Eb, A. J. A new technique for the assay of infectivity of human adenovirus 5 DNA. Virology. 52, 456-467 (1973).
- Craig, A. M., Banker, G. a. G. K. Transfecting cultured neurons. Culturing Nerve Cells. , (1998).
- Alavian, K. N., et al. Bcl-xL regulates metabolic efficiency of neurons through interaction with the mitochondrial F1FO ATP synthase. Nat. Cell Biol. 13, 1224-1233 (2011).
- Zhang, Y., et al. Modulation of synaptic function by VAC14, a protein that regulates the phosphoinositides PI(3,5)P(2) and PI(5)P. EMBO J. 31, 3442-3456 (2012).
- Dudek, H., Ghosh, A., Greenberg, M. E. Calcium phosphate transfection of DNA into neurons in primary culture. Curr. Protoc. Neurosci. Chapter 3, Unit 3 11 (2001).
- Goslin, K. A. H., Banker, G., Banker, G. a. G. K. Rat Hippocampal Neurons in Low-Density Culture. Culturing Nerve Cells. , (1998).
- Kohrmann, M., et al. Fast, convenient, and effective method to transiently transfect primary hippocampal neurons. J. Neurosci. Res. 58, 831-835 (1999).
- Jiang, M., Chen, G. High Ca2+-phosphate transfection efficiency in low-density neuronal cultures. Nat. Protoc. 1, 695-700 (2006).
- Goetze, B., Grunewald, B., Baldassa, S., Kiebler, M. Chemically controlled formation of a DNA/calcium phosphate coprecipitate: application for transfection of mature hippocampal neurons. J. Neurobiol. 60, 517-525 (2004).
