יחיד לטוס Assay עבור התנהגות שיחור מזון ב<em> דרוזופילה</em
Summary
במאמר זה וידאו, אנו מתארים assay אוטומטי כדי למדוד את ההשפעה של רעב או שובע על התנהגות חיפוש מזון תלויה בריח הפירות המבוגרים לעוף melanogaster דרוזופילה.
Abstract
לבעלי חיים רבים, רעב מקדם שינויים במערכת ההרחה באופן שמקל את החיפוש אחר מקורות מזון מתאימים. במאמר זה וידאו, אנו מתארים assay אוטומטי כדי למדוד את ההשפעה של רעב או שובע על התנהגות חיפוש מזון תלויה בריח הפירות המבוגרים לעוף melanogaster דרוזופילה. בתיבת אור חזק המוארת באור אדום שהוא בלתי נראה לזבובי פירות, מצלמה קשורה לתוכנת רכישת נתונים המותאמת אישית עוקבת אחר מצבם של שישה זבובים בו זמנית. כל זבוב הוא מוגבל ללכת בזירות בודדות המכילות ריח אוכל במרכז. זירות הבדיקות לנוח על רצפה נקבובית שפונקציות כדי למנוע הצטברות ריח. חביון לאתר את מקור הריח, מדד המשקף את רגישות חוש הריח תחת מצבים פיסיולוגיים שונים, נקבע על ידי ניתוח תוכנה. כאן, אנו דנים את המכניקה הקריטית של הפעלת הפרדיגמה ההתנהגות הזה ונכסה נושאים ספציפיים לגבי loadi זבובng, זיהום ריח, טמפרטורת assay, איכות נתונים, וניתוח סטטיסטי.
Introduction
הברית הרעב לקדם שני סוגים של התנהגויות תיאבון: חיפוש מזון וצריכת מזון 1. assay התנהגותיים פשוט זו שימושי לחקר התנהגויות הקשורות לחיפוש מזון chemotactic 2,3. באופן ספציפי, הוא עוקב אחר עמדה לטוס, מהירות הליכה והשהיה לאיתור יעד ריח אוכל. מיסות של ממצא מזון משמשת כמדד למדידת שינויים ברגישות של מערכת זיהוי הריח של הזבוב במורד הזרם של שינויים במצב התיאבון הפנימי שלה. גרסה ידנית של assay זה הייתה בשימוש בעבר כדי להראות איתות הקולטן GABA-B חשובה ללוקליזציה ריח התנהגות במבוגרים עף 3. הגרסה האוטומטית הנוכחית של assay סייעה במחקר של כמה קצר איתות נוירופפטידים-F (sNPF) מעצבת מחדש את מפת חוש הריח בדרוזופילה והשפעות appetitive התנהגויות 2.
בדיקה נעשה בחדר מבוקר כהה, טמפרטורה ולחות. דיגיטלימצלמות וידאו נקבעות מעל צלחות בדיקות אקריליק ברורות לעקוב אחר הזבובים מוארים בתאורת LED 660 ננומטר. מידע מהמצלמה מעובד בזמן אמת על ידי מחשב שהוצב בסמוך לאזור הבדיקה. אנו משתמשים בתוכנת רכישת נתונים כדי להקליט ולשמור את הקואורדינטות של עמדות לטוס בתקופת הבדיקה.
בפרדיגמה זו, הנושא הוא שוחרר לזירה המכילה ריח אוכל במרכז; אובייקט הריח יוצר שיפוע ריח אוכל בזירה שגורמת מזון התנהגות חיפוש בזבוב. פרוטוקול חיפוש ריח דומה כבר מיושם כלפי המחקר של chemosensation בזחלי דרוזופילה אחת 7. בעוד מבחני התנהגות אחרים כגון ארבעת שדה olfactometer 4,5 או t-מבוך 6 להעריך התנהגויות סלידה או משיכה ריח, פרדיגמה זו היא מתאימה ביותר כדי להעריך התנהגויות רגישות וchemotaxis חוש הריח.
כמה יתרונות מרכזיים ילוו את אסא זהy. ראשית, הוא מאפשר רכישה מהירה של ערכות נתונים גדולות, כי איסוף הנתונים וניתוחם בעיקר אוטומטיים. שנית, assay זה מבודד ומודד את התנהגותם של זבובים יחיד, ובכך לחסל רמזי חוש הריח חברתיים שעשויים להשפיע על ההתנהגויות שלהם. שלישית, את הפשטות של הפרוטוקול ועיצוב ניסיוני פשוט לעשות את assay יעיל וקל ללמד אחרים.
בנוסף, assay זה יכול לשמש כדי לחקור עוד יותר מעגלים עצביים שבבסיס מזון התנהגות חיפוש על ידי שילוב עם ערכת הכלים הגנטיים הנרחב זמינים לmelanogaster דרוזופילה 8. ביטוי ממוקד של transgenes שניתן להשיג תאי עצב שתיקה או לרגש עם כלים כגון מערכת GAL4-כטב"מ כמו גם TS1 כטב"מ-shibire, כטב"מ-טטנוס הרעלן, וכטב"מ-TrpA1 (ב ') transgenes 9-12.
Protocol
Representative Results
Discussion
בפרוטוקול זה, אנו מתארים הליך צעד אחר צעד עבור assay חיפוש מזון ההתנהגות. בנוסף לריחות מזון קשור, היא עשויה גם להיות מותאמת ללימוד היכולת של הזבוב כדי לאתר אובייקטי ריח אחרים. לדוגמא, זה יכול להיות מיושם כלפי המחקר של בן זוג לוקליזציה התנהגות בזבובי זכרי 3 ישנם כמה ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי מענקי מחקר לJWW מהמכון הלאומי לבריאות (R01DK092640) והקרן הלאומית למדע (0,920,668).
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| Apple Cider Vinegar | Spectrum | commercially available | |
| Agarose, Type VII | Sigma-Aldrich | A0701 | low gelling temperature agarose |
| Acrylic Testing Plate | custom | Plate contains 6 arenas. Each arena is 60 mm in diameter 6 mm in height. See testing plate diagrams for specific measurements. | |
| LabVIEW V.8.5 | National Instruments | 776670-09 | platform for programs: PositioningTool.vi, FlyTracking–Six Zones.vi NOTE: "elapsed time.vi", "time into file.vi", and "two object detect.vi" are included subroutines that must be available in order for the main data acquisition program "FlyTracking–Six zones.vi" to run. |
| LabVIEW Vision 8.5 | |||
| LabVIEW Vision Acquisition Software 8.5 | |||
| LabVIEW Vision Builder AI 3.5 | |||
| Igor Pro V.6 | Wavemetric, Inc. | platform for macro: Data Analysis for Fly Tracking–Six Zones | |
| Basler scA1390-17fm | National Instruments | 779980-01 | Digital Camera NOTE: driver for camera available at Baslerweb.com |
| 8 mm lens | National Instruments | 780024-01 | Lens for Basler Digital Camera |
| Ground Glass Diffuser Plate | Edmund Optics | custom | Diffuses light, 25 cm x 30 cm |
| US Std. No. 100 | Fischer Scientific | 04-881X | Sieve with nominal opening of 150 μm |
| Lighting Option 1 | |||
| LED backlight 660 nm (20 cm x 20 cm) | Spectra West | BL47192 | a simpler but more expensive lighting option. |
| Power Supply for LED Backlight | Spectra West | ||
| Lighting Option 2 | |||
| 660 nm LEDs | Superbrightleds | RL5R1330 | Wavelength 660 nm (approximately 7 x 7 LED array for a 14.7 inch x 9.75 inch panel) |
| Linear DC Power Supply | GW Instek | GPS-1830D | Power supply for LED Panel |
| Solderless Breadboard | Digikey | 922354-ND | Breadboard for LEDs |
References
- Dethier, V. G. . The hungry fly : a physiological study of the behavior associated with feeding. , (1976).
- Root, C. M., Ko, K. I., Jafari, A., Wang, J. W. Presynaptic facilitation by neuropeptide signaling mediates odor-driven food search. Cell. 145, 133-144 (2011).
- Root, C. M., et al. A presynaptic gain control mechanism fine-tunes olfactory behavior. Neuron. 59, 311-321 (2008).
- Semmelhack, J. L., Wang, J. W. Select Drosophila glomeruli mediate innate olfactory attraction and aversion. Nature. 459, 218-223 (2009).
- Faucher, C., Forstreuter, M., Hilker, M., de Bruyne, M. Behavioral responses of Drosophila to biogenic levels of carbon dioxide depend on life-stage, sex and olfactory context. J. Exp. Biol. 209, 2739-2748 (2006).
- Quinn, W. G., Harris, W. A., Benzer, S. Conditioned behavior in Drosophila melanogaster. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 71, 708-712 (1974).
- Fishilevich, E., Domingos, A. I., Asahina, K., Naef, F., Vosshall, L. B., Louis, M. Chemotaxis behavior mediated by single larval olfactory neurons in Drosophila. Curr. Biol. 15, 2086-2096 (2005).
- Venken, K. J., Simpson, J. H., Bellen, H. J. Genetic manipulation of genes and cells in the nervous system of the fruit fly. Neuron. 72, 202-230 (2011).
- Hamada, F. N., et al. An internal thermal sensor controlling temperature preference in Drosophila. Nature. 454, 217-220 (2008).
- Kitamoto, T. Conditional modification of behavior in Drosophila by targeted expression of a temperature-sensitive shibire allele in defined neurons. J. Neurobiol. 47, 81-92 (2001).
- Sweeney, S. T., Broadie, K., Keane, J., Niemann, H., O’Kane, C. J. Targeted expression of tetanus toxin light chain in Drosophila specifically eliminates synaptic transmission and causes behavioral defects. Neuron. 14, 341-351 (1995).
- Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118, 401-415 (1993).
