Kemirgen Enterik Sinir progenitörlerin için Kantitatif Hücre Göç Tahlili
Summary
Çeşitli büyüme faktörlerinin varlığında enterik nöral tepe hücre göçü potansiyelinin hassas miktar tayinine izin veren bir ex vivo hücre göçü deneyi mevcut.
Abstract
Nöral krest hücreleri (KKK) dorsal nöral tüp kaynaklanan ve gelişmekte olan omurgalı embriyo boyunca yoğun göç geçici ve multipotent hücre popülasyonu vardır. Çevresel glia ve nöronlar sağlamanın yanı sıra, NCC melanositler gibi kranyo-yüz iskeletinin en üretir. NCC göç ve farklılaşma nöral tüp ve bölgesel olarak farklı hücre dışı uyaranlara maruz kaldıkları boyunca eksenel kökenli bir kombinasyonu ile kontrol edilmektedir. Hücre dışı ligandlar Bu katkı enterik sinir sistemi (ENS), karmaşık bağlantılı (diğer şeyler arasında) lokal olarak kontrol nöral ganglia ağı bağırsak, kas hareketi ve intestinal motilite oluşumu sırasında, özellikle belirgindir. Kaudal moda bir rostral – – müstakbel bağırsak tüm uzunluğu ENS çoğu kolonize etmek için uzun bir yolculuğa üstlenmek KKK başlangıçtaki küçük bir havuz türetilmiştir. Bilinen çeşitli sinyal yolları arasında,enterik KKK kolonizasyonu etkileyen, GDNF / RET sinyal en önemli olarak kabul edilmektedir. Nitekim, bağırsak mezenşimin tarafından RET ligand GDNF'nin spatiotemporally kontrollü salgılanması embriyonik gut ve içinde cazibe ve RET-ifade enterik KKK rehberlik için başlıca sorumludur. Burada, GDNF gibi çeşitli büyüme faktörlerinin varlığında enterik NCC göç potansiyeli hassas miktar tayinine izin veren, floresanla işaretlenmiş NCC, sahip olan bir transgenik fare hattı yararlanarak, bir ex vivo hücre göçü deneyi tarif eder.
Introduction
Nöral tepe hücreleri (NCC) embriyo gelişim boyunca bir çok omurgalı türevler meydana özgü bir geçici hücre türüdür. Bu hücre popülasyonu nöral olmayan ektoderm 1 bitişik sinirsel levha, sınırında ortaya çıkar. Nörülasyon sırasında oluşturan nöral tüpün dorsal kenarı boyunca nöral plak yerlerden KKK arasında eğilme. KKK sonra ayrılması ve uzak nöral tüp göç, epitel-mezenkimal geçiş tabi. KKK onlar tüm enterik sinir sistemi (ENS) oluşturmak sindirim sistemi, bağırsak duvarında gömülü nöral ganglionlarda birbirine bağlı bir ağ dahil olmak üzere çeşitli embriyonik yapılar, kolonize. Geçenlerde 2,3 gözden gibi, birçok genin bu karmaşık yapının geliştirilmesi dahil edilmiştir.
ENS çoğu (yani müstakbel Beyin / omurilik sınırındaki civarında) vagal nöral tüp KKK menşeli küçük bir havuz türetilmiştir 4.Bunlar sinir atalarıdır farelerde embriyonik gün (E) 9.0 etrafında foregut ulaşmak ve yaklaşık e15.0 tüm embriyonik bağırsakları kolonize kadar sonra bağırsak mezenşimin içinde caudally göç. Kolon sinir progenitörlerinin Küçük bir alt kümesi, aynı zamanda yukarı çekum 4 ters yönde arka bağırsak işgal sakral NCC, tarafından sağlanır. Vagal ve sakral Hem NCC gerektiren birden fazla göç-çoğalma-, ENS tam oluşmasını sağlamak için hayatta kalma ve farklılaşma-teşvik ipuçları. Bu bağlamda, hayvan modelleri, – özellikle de genetik olarak modifiye edilmiş farenin – birkaç temel hücre dışı ligandların belirlenmesi vesile olmuştur: GDNF (gliyal hücre-türevi nörotropik faktör), endotelin-3, nörotrofin-3, BMP (kemik morfojenik proteinler), netrin , hem de sonik ve Hint Hedgehog (Shh ve Ihh) 5-10. Bunlardan, (transfeksiyon sırasında Rearranged) transmembran reseptör tirozin kinaz yoluyla sinyal RET GDNF inci olarak kabul edilmektedirembriyonik gut ve içinde cazibe ve KKK rehberlik e en kritik yolu. GDNF bağırsak mezenşimin tarafından salgılanan ve RET 11,12 ifade enterik KKK, doğrudan kemoatraktif bir spatiotemporally kontrollü rosrrocaudal degrade oluşturur.
Diğer fonksiyonlar arasında, ENS bağırsak duvarında düz kas ile etkileşim yoluyla sindirim sistemi içinde hareketini düzenler. Hirschsprung hastalığında bağırsak sonuçların terminal bölgesinde nöral ganglia olmaması: etkilenen segmentin tonik kasılma tıkanması, sindirilmiş madde birikimi ve üst bağırsak ve karın büyük bir şişkinlik yol açar. Hirschsprung hastalığı yaklaşık 5,000 canlı doğumda oluşur. Enterik KKK rostro-kaudal göç desen Hirschsprung hastalığının etiyolojisinde ana bir faktör olduğuna inanılmaktadır. KKK ve b son bölümünü göç kaynağından kolon, uzakkolonize edilmesi Owel, ENS oluşumunda hatalarına karşı en hassas olduğunu. Enterik NCC göç onun önemli rol ile uygun olarak, GDNF / RET sinyal bozulması Hirschsprung hastalığı 13'ün ana bilinen genetik bir nedenidir.
[5kb]-GFP 14 Gata4p adında – – Göçmen KKK Yeşil Floresan Protein (GFP) ile etiketli olduğu daha iyi KKK ve ENS gelişimini incelemek için, biz bir transgenik fare hattı oluşturulur. Gelecek artık, GDNF gibi çeşitli büyüme faktörlerinin varlığında enterik NCC göç potansiyeli hassas miktar tayinine izin veren diğer gruplara 11,12,15 tarafından yayınlanmış çalışmadan adapte edilen bir ex vivo hücre göçü deneyi, mükemmel.
Protocol
Representative Results
Discussion
Biz ex vivo eksplant kültürü tekniği tam GDNF mevcudiyetinde enterik NCC göç potansiyeli ölçmek için nasıl kullanılabileceğini göstermektedir. Bu tür kesin miktar büyük ölçüde daha önce tarif edildiği gibi 11,12,15, 200 mikron kalınlığında bir vibratome bağırsak bölümleri kullanılarak yerine yaklaşık boyutu büyük parça tarafından kolaylaştırılır. Gerçekten de, bu bizi son derece tekrarlanabilir bir ortamda hücrelerin makul bir sayı ile çalışmak için izin…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Biz görüntü işleme ve analiz için tavsiye Denis Flipo teşekkür ve David W. Silversides kimin laboratuvar olarak Gata4p [5kb]-GFP fare hattı oluşturuldu. Pilon Araştırma laboratuvarında CIHR, NSERC, FRQS ve FRQNT tarafından finanse edilmektedir.
Materials
| DMEM powder | Wisent | 219-010-XK | |
| NaHCO3 | Bioshop | SOB999 | Biotechnology grade |
| Steriflip vacuum filtration system (0.22 micron) | EMD Millipore | SCGP00525 | |
| Penicilin-Streptomycin solution, 100x | Wisent | 450-201-EL | |
| Fetal bovine serum | Wisent | 095-150 | High quality grade |
| Collagen I | BD biosciences | 354236 | |
| NaOH | Bioshop | SHY700 | Diluted from 10 N stock then sterile-filtered |
| GDNF | Cedarlane | CLCYT305 | |
| Falcon 24-well Plate | BD biosciences | 353047 | |
| Dissecting scissors | Fisher Scientific | 089515 | |
| Glass Petri dish | VWR | 89000-306 | |
| PBS | Sigma | P5493 | Cell culture grade |
| Dissecting microscope | Leica | M125 | |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11251-20 | |
| Agarose | Bioshop | AGA001 | Biotechnology grade |
| Surgical blade | Feather | 21 | |
| All Purpose Instant Krazy Glue Pen | Krazy Glue | KG824 | |
| HM 650V Vibrating-Blade Microtome | Thermo Scientific | 920110 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9564 |
References
- Bronner, M. E., Le Douarin, N. M. Development and evolution of the neural crest: An overview. Dev. Biol. 366 (1), 2-9 (2012).
- Bergeron, K. F., Silversides, D. W., Pilon, N. The developmental genetics of Hirschsprung’s disease. Clin. Genet. 83 (1), 15-22 (2013).
- Obermayr, F., Hotta, R., Enomoto, H., Young, H. M. Development and developmental disorders of the enteric nervous system. Nat. Rev. Gastroenterol. Hepatol. 10 (1), 43-57 (2012).
- Sasselli, V., Pachnis, V., Bursn, A. J. The enteric nervous system. Dev. Biol. 366 (1), 64-73 (2012).
- Sanchez, M. P., Silos-Santiago, I., et al. Renal agenesis and the absence of enteric neurons in mice lacking GDNF. Nature. 382 (6586), 70-73 (1996).
- Baynash, A. G., Hosoda, K., et al. Interaction of endothelin-3 with endothelin-B receptor is essential for development of epidermal melanocytes and enteric neurons. Cell. 79 (7), 1277-1285 (1994).
- Chalazonitis, A., Pham, T. D., et al. Neurotrophin-3 is required for the survival-differentiation of subsets of developing enteric neurons. J. Neurosci. 21 (15), 5620-5636 (2001).
- Goldstein, A. M., Brewer, K. C., Doyle, A. M., Nagy, N., Roberts, D. J. BMP signaling is necessary for neural crest cell migration and ganglion formation in the enteric nervous system. Mech. Dev. 122 (6), 821-833 (2005).
- Jiang, Y., Liu, M. T., Gershon, M. D. Netrins and DCC in the guidance of migrating neural crest-derived cells in the developing bowel and pancreas. Dev. Biol. 258 (2), 364-384 (2003).
- Ramalho-Santos, M., Melton, D. A., McMahon, A. P. Hedgehog signals regulate multiple aspects of gastrointestinal development. Development. 127 (12), 2763-2772 (2000).
- Natarajan, D., Marcos-Gutierrez, C., Pachnis, V., de Graaf, E. Requirement of signaling by receptor tyrosine kinase RET for the directed migration of enteric nervous system progenitor cells during mammalian embryogenesis. Development. 129 (22), 5151-5160 (2002).
- Young, H. M., Hearn, C. J., et al. GDNF Is a chemoattractant for enteric neural cells. Dev. Biol. 229 (2), 503-516 (2001).
- Amiel, J., Sproat-Emison, E., et al. Hirschsprung disease, associated syndromes and genetics: a review. J. Med. Genet. 45 (1), 1-14 (2008).
- Pilon, N., Raiwet, D., Viger, R. S., Silversides, D. W. Novel pre- and post-gastrulation expression of Gata4 within cells of the inner cell mass and migratory neural crest cells. Dev. Dyn. 237 (4), 1133-1143 (2008).
- Nagy, N., Goldstein, A. M. Endothelin-3 regulates neural crest cell proliferation and differentiation in the hindgut enteric nervous system. Dev. Biol. 293 (1), 203-217 (2006).
- Nagy, A., Gertsenstein, M., Vintersen, K., Behringer, R. . Manipulating the mouse embryo: a laboratory manual. , 209-250 (2003).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat. Methods. 9, 671-675 (2012).
- Byth, K. F., Thomas, A., et al. AZD5438, a potent oral inhibitor of cyclin-dependent kinases 1, 2, and 9, leads to pharmacodynamic changes and potent antitumor effects in human tumor xenografts. Mol. Cancer Ther. 8 (7), 1856-1866 (2009).
