Un protocole pour la livraison intracanalaire non-invasive de réactifs aqueux de la glande mammaire de la souris est décrite. La méthode prend avantage de l'injection localisée dans les mamelons des glandes mammaires ciblant spécifiquement conduits mammaires. Cette technique est adaptable à une variété de composés comprenant siRNA, les agents chimiothérapeutiques et les petites molécules.
Nous décrivons ici un protocole de livrer divers réactifs à la glande mammaire de souris par des injections intra-canalaires. Délivrance de médicament localisée et le knock-down de gènes au sein de l'épithélium mammaire a été difficile à réaliser en raison de l'absence de molécules de ciblage appropriés qui sont indépendantes des étapes de développement, tels que la grossesse et l'allaitement. Nous décrivons ici une technique pour la délivrance localisée de réactifs de la glande mammaire à un stade quelconque à l'âge adulte par injection intracanalaire dans les tétons de souris. Les injections peuvent être effectuées sur les souris vivantes, sous anesthésie, et de permettre une délivrance de médicament non-invasive et localisée à la glande mammaire. En outre, les injections peuvent être répétées sur plusieurs mois sans endommager le mamelon. Colorants vitaux tels que Bleu Evans sont très utiles pour apprendre la technique. Lors de l'injection intra-canalaire du colorant bleu, l'arbre canalaire entier devient visible à l'œil. En outre, des réactifs marqués par fluorescence permettent égalementvisualisation et la distribution au sein de la glande mammaire. Cette technique est adaptable à une variété de composés comprenant siRNA, les agents chimiothérapeutiques, et des petites molécules.
La glande mammaire de la souris est composé d'un arbre canalaire-alvéolaire complexe qui converge dans un canal central au niveau du mamelon. Chez la souris, ainsi que les humains, la majorité des tumeurs du sein sont créés dans les cellules epitheliales qui tapissent les conduits de lait. Traitements actuellement disponibles incluent la chimiothérapie par voie intraveineuse, la radiothérapie et la chirurgie. Traitements canalaires localisées ont été explorées 1-3 et offrir des avantages significatifs en termes de toxicité et des effets secondaires réduits. Toutefois, plusieurs défis restent à relever avant ceux-ci peuvent être appliqués plus largement. La possibilité d'effectuer des procédures comparables dans la glande mammaire de la souris facilite la caractérisation des interventions intra-canalaires. Nous présentons ici une méthode non-invasive pour la fourniture de réactifs directement dans le conduit mammaire de la souris.
Intracanalaire livraison d'agents chimiothérapeutiques dans les deux patients atteints de cancer du sein et des modèles de souris a été démontré précédemment pour être très efficace sans aucun signe detoxicité systémique ou histopathologique changements à long terme de 3-6. En outre, l'injection des cellules tumorales et la livraison de vecteur lentiviral d'oncogènes ont été précédemment montré pour être réalisable par injection intracanalaire 7-10.
En plus de l'administration de médicaments, ce procédé est utile pour le silençage de gènes locale de la glande mammaire par injection de siRNA intracanalaire. Injection de petits volumes de solution siRNA est efficace sans modifier l'anatomie et de la physiologie de la glande mammaire. Dans notre laboratoire, nous avons récemment montré inactivation réussie de gènes de médiateurs clés dans des souris transgéniques qui développent spontanément des tumeurs mammaires résultant dans la prévention de la progression de la tumeur (Brock et al., Non publié). Nous avons été en mesure de répéter les injections toutes les deux semaines dans les mêmes mamelons jusqu'à 7 fois à intervalle de 2 semaines sans endommager les tissus visible ou toxicité.
Injections intra-canalaires peuvent être synchronisées dans une souris adulte pour traiter développementévénements opmentally spécifiques relatives au développement de la glande mammaire pendant la grossesse, l'allaitement, et de l'involution ou de cibler les étapes ultérieures au cours du développement et la progression tumorale. Les femelles vierges aussi jeunes que 8 semaines d'âge ont été injectés de façon non invasive dans notre laboratoire.
souris transgéniques knockout et sont des outils précieux pour étudier le rôle in vivo de gènes individuels dans le cancer du sein. Cependant, il est coûteux et prend du temps pour créer ces animaux et l'inactivation génique est généralement omniprésente qui nous empêche parfois de reconnaître les effets spécifiques de ce gène sur la glande mammaire. Par conséquent, un effet de choc ciblée permettrait d'atténuer les problèmes d'effets secondaires et la toxicité non spécifique dans d'autres organes.
L'injection intra-canalaire de siRNA présenté ici permet à l'inactivation génique localisée dans la glande mammaire de la souris. Il s'agit d'une méthode rapide pour une administration de médicament ciblée et localisée à la glande mammaire ne se limite pas à la délivrance d'ARNi. Une telle délivrance de médicament spécifique à la glande mammaire d'éviter les effets secondaires et la toxicité non spécifique à d'autres organes, et permet l'étude des altérations des gènes à des moments spécifiques au cours du développement de la glande mammaire et la formation de tumeurs du sein. Il n'existe aucune preuve de siparticules d'ARN dans les glandes non-injectés, le foie ou d'autres organes qui fournissent des preuves supplémentaires que ce procédé présente un moyen pratique pour inactivation génique localisée dans la glande mammaire. En outre, les injections intra-canalaires peuvent être répétées toutes les semaines ou toutes les deux semaines pendant plusieurs mois pour permettre un suivi à long terme des agents thérapeutiques.
Cette technique offre la possibilité de dosage de la livraison intracanalaire de divers réactifs aux conduits mammaires de souris. Les progrès de la délivrance localisée dans des modèles murins bien caractérisés doivent accélérer l'application du non-invasive, ciblée stratégies thérapeutiques chez l'homme.
The authors have nothing to disclose.
Les auteurs tiennent à remercier Michael Goldberg pour préparer la solution de siRNA stabilisé et Heather Tobin pour son aide avec les animaux. Cette étude a été financée par le DOD Innovator Award W81XWH-08-1-0659 de DEI. La formation postdoctorale de SK a été soutenu par la fondation Susan G Komen (KG101329). Les auteurs tiennent à remercier Kristin Johnson pour la préparation du schéma.
Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
isoflurane | 2-4% | ||
meloxicam | 5-10 mg/ml | ||
Evans blue dye | Sigma-Aldrich | E2129-10G | 0.2% in PBS |
hair removing cream | Veet | Choose sensitive option | |
stereoscope | Zeiss | Stemi DV4 | |
micro-dissecting tweezers | Roboz | rs-4976 | With a 0.10 x 0.06 mm tip made of dumostar |
Hamilton syringe | Hamilton | 7637-01 | |
33-gauge needle | Hamilton | 7803-05 | point style 4, 12 degree bevel (standard) |
siGLO cyclophilin B control siRNA | Dharmacon | D-001610-01-05 |