Анализ жирных кислот содержание и состав микроводорослей

Жирные кислоты являются одним из основных компонентов микроводорослей биомассы и обычно составляют от 5-50% клеточной сухого веса ^1-3. Они в основном присутствуют в виде глицеролипидов. Эти глицеролипиды, в свою очередь состоят в основном из фосфолипидов, гликолипидов и триглицеридов (TAG). Особенно жирные кислоты, присутствующие в TAG имеют коммерческий интерес, потому что они могут быть использованы в качестве ресурса для производства транспортного топлива, сыпучих химических веществ, биологически активные добавки (ω-3 жирных кислот), а также продовольственных товаров ^3-6. Микроводорослей может расти в морской воде на основе выращивания СМИ, может иметь гораздо более высокую поверхностную производительность, чем наземных растений, и могут быть выращены в фотобиореакторов в местах, непригодных для сельского хозяйства, возможно, даже в море. По этим причинам, микроводоросли часто считают перспективной альтернативой наземных растений для производства биодизеля и других сыпучих продуктов ^3-6. не Потенциально не сельскохозяйственного ли или пресная вода (при культивировании в закрытых фотобиореакторов или когда морские водоросли используются) необходим для их производства. Таким образом, биотопливо, полученные из микроводорослей считаются 3 биотопливо ^й поколения.

Общий клеточный содержание жирных кислот (% от сухого веса), состав класса липидов, а также длины жирных кислот и степени насыщения сильно варьируют между микроводорослей видов. Кроме того, эти свойства меняются в зависимости от условий культивирования, такие как наличие питательных веществ, температуры, рН и интенсивности света ^1,2. Например, при воздействии азотного голодания, микроводоросли могут накапливаться в больших количествах TAG. При оптимальных условиях роста TAG обычно составляет менее 2% от сухого веса, но при контакте с азотного голодания содержания TAG может увеличиться до до 40% от микроводорослей сухого веса ^1.

Микроводорослей в основном производят жирные кислоты с длиной цепи от 16 до 18атомы углерода, но некоторые виды могут сделать жирных кислот вплоть до 24 атомов углерода в длину. Оба насыщенный а также ненасыщенных жирных кислот получают путем микроводорослей. К последним относятся жирные кислоты с питательной ценности (ω-3 жирных кислот), как С20: 5 (эйкозапентаеновая кислота; ЭПК) и С22: 6 (докозагексаеновая кислота; DHA), для которых нет растительные альтернативы не существуют ^1,2,4,7. (Распределение) жировой длины цепи кислоты и степени насыщения также определяет свойства и качества водорослей, полученных биотоплива и пищевыми маслами ^4,8.

Для разработки коммерческих приложений микроводорослей происходит жирных кислот, надежные аналитические методы для количественного определения содержания кислоты жирного и состава необходимы.

Кроме того, как указал Ryckebosch др.. ^9, анализ жирных кислот в микроводорослей отличается от других субстратов (например, растительное масло, продукты питания, ткани животных и т.д.) бытьвызвать 1) микроводорослей одиночные клетки, окруженные жесткими стенками клеток, что затрудняет экстракции липидов, 2) микроводоросли содержат широкий спектр классов липидов и распределение липидов класс сильно варьирует ^7. Эти различные классы липидов имеют широкий спектр по химической структуре и свойствам, таким как полярности. Кроме того, липидные классы, кроме ацильных липидов производятся; 3) микроводоросли содержат широкий спектр жирных кислот, в пределах от 12-24 атомов углерода в длину и содержит как насыщенные, так и ненасыщенных жирных кислот. Таким образом, методы, разработанные для анализа жирных кислот в других, чем микроводорослей субстратов, могут не подходить для анализа жирных кислот в микроводорослей.

Как показали в Ryckebosch др.. ^9, основное различие между наиболее часто используемых процедур экстракции липидов в растворителя-систем, которые используются. Из-за большого разнообразия липидных классов, присутствующих в микроводорослей, каждый разной полярности, извлеченныйколичество липидов будет варьировать в зависимости растворителей, используемых ^10-12. Это приводит к несогласованности в содержании липидов и композиции, представленные в литературе ^9,10. В зависимости от системы используемого растворителя, методы, основанные на экстракции растворителем без разрушения клеток через, например, шарик избиение или ультразвуком, не могли бы извлечь все липиды из-за жесткой конструкции некоторых видов микроводорослей ^9,13. В случае неполного экстракции липидов, эффективность экстракции из различных классов липидов может изменяться ^14. Это также может оказывать влияние на измеренного состава жирных кислот, так как состав жирных кислот является переменной между липидными классов ^7.

Наша методика основана на последовательности механическое разрушение клеток, экстракции липидов на основе растворителя, переэтерификацией жирных кислот в метиловых эфиров жирных кислот (Fames), а также количества и идентификации МЭЖК с использованием газовой хроматографии в сочетании с ионизации пламениДетектор уравнение (GC-FID). Внутреннего стандарта в виде триглицеридов (tripentadecanoin) добавляют до аналитической процедуры. Возможные потери при добыче и неполного переэтерификации затем могут быть исправлены в течение. Метод может быть использован для определения содержания а также состав жирных кислот, присутствующих в микроводорослей биомассы. Все жирные кислоты, присутствующие в различных ацил-липидной классов, включая хранение (TAG), а также мембранные липиды (фосфолипиды, гликолипиды), которые обнаружены, определенные и количественно точно и воспроизводимо этим методом, используя только небольшое количество образца (5 мг) . Этот метод не дает информации о относительного обилия различных классов липидов. Однако метод может быть расширен, чтобы отделить классы липидов друг от друга ^1. Состав концентрация кислоты и жирных из различных классов липидов может быть определена индивидуально.

В литературе несколько другие методыописано для анализа липидов в микроводорослей. Некоторые методы сосредоточиться на общих липофильных компонентов ^15, в то время как другие методы сосредоточиться на общего количества жирных кислот ^9,16. Эти альтернативы включают весового определения общего извлеченных липидов, прямой транс-этерификации жирных кислот в сочетании с количественной использованием хроматографии, и окрашивания клеток с липофильных красителей люминесцентных.

Обычно используется альтернатива количественной оценки жирных кислот с использованием хроматографии является количественная оценка липидов с помощью весового определения ^17,18. Преимущества весового определения являются отсутствие требований к передовой и дорогостоящего оборудования, как газовый хроматограф; облегчить настроить процедуру, из-за наличия стандартизированного аналитического оборудования (например Сокслета) и гравиметрические определения меньше времени, чем хроматографии на основе методов. Основное преимущество использования хроматографию, основанную на методы др.ER рука является то, что в таком способе измеряют только жирные кислоты. В весовом определении не-жирной кислоты, содержащий липиды, как пигменты или стероидов, также учитывается при определении. Эти не жирных кислот, содержащие липиды могут составить значительную долю (> 50%) общих липидов. Если заинтересован только в содержания жирных кислот (например, для применения биодизеля), он будет переоценить при использовании гравиметрических определение. Кроме того, в весовом определении точность аналитических весах используются для взвешивания извлеченные липиды определяет размер выборки, которая должна быть использована. Эта величина обычно значительно больше, чем количество, необходимое при использовании хроматографии. И, наконец, еще одно преимущество с помощью хроматографии на весового определения является то, что хроматографии дает информацию о составе жирных кислот.

Еще одной альтернативой нашей предложенного метода является прямым переэтерификации ^16,19,20.В этом методе экстракции липидов и переэтерификации жирных кислот в МЭЖК объединены в одну стадию. Этот способ быстрее, чем отдельный экстракции и переэтерификации шаг, но сочетания этих шагов ограничивает растворители, которые могут быть использованы для извлечения. Это может негативно повлиять эффективность экстракции. Еще одним преимуществом отдельного экстракции липидов и переэтерификации стадии, что она позволяет для дополнительного разделения класса липидов между этими шагами ^1. Это невозможно при использовании прямой переэтерификации.

Другие часто используемые методы для определения содержания липидов в микроводорослей включают окрашивания биомассы с липофильных флуоресцентных красителей, таких как Нил красный или BODIPY и измерения сигнала флуоресценции ^21,22. Преимуществом этих методов является то, что они менее трудоемкий, чем альтернативные методы. Недостатком этих методов является то, что флуоресцентный ответ, по разным причинам, переменная между SPECIэс, условия культивирования, классы липидов и аналитические процедуры. В качестве примера, некоторые из этих изменений обусловлены различия в поглощения красителя в микроводорослей. Калибровка с помощью другого количественный метод Поэтому необходимо, предпочтительно выполняется для всех различных условий культивирования и стадий роста. Наконец, этот метод не дает информации о составе жирных кислот и является менее точным и воспроизводимым, чем хроматографии на основе методов.

Представленный способ основан на методике, описанной Lamers соавт. ²³ и Santos соавт. ²⁴ и также применяется в различных других авторов ^1,25-27. Существуют и другие методы доступны, которые основаны на тех же принципах и может обеспечить аналогичные результаты ^9,28.