Ex vivo analysis of arterial lesions from animal models of cardiovascular disease classically relies on histological and immunohistochemical techniques. These provide 2-dimensional measurements in 3-dimensional lesions. This manuscript describes the generation of arterial lesions for quantitative analysis in 3-dimensions using optical projection tomography.
La generazione e l'analisi delle lesioni vascolari in modelli animali appropriati è una pietra miliare della ricerca sulle malattie cardiovascolari, generando importanti informazioni sulla patogenesi della formazione della lesione e l'azione di nuove terapie. L'uso di aterosclerosi inclini topi, metodi chirurgici di induzione della lesione, e modificazioni della dieta è migliorata notevolmente la comprensione dei meccanismi che contribuiscono allo sviluppo della malattia e il potenziale di nuovi trattamenti.
Classicamente, analisi delle lesioni viene effettuata ex vivo utilizzando tecniche istologiche 2-dimensionali. Questo articolo descrive l'applicazione della tomografia ottica di proiezione (OPT) per la quantificazione 3 dimensioni delle lesioni arteriose. Poiché questa tecnica è non distruttiva, può essere utilizzato in aggiunta ad analisi istologiche e immunoistochimiche standard.
Lesioni neointimale sono state indotte da filo-inserimento o legatura del mouse femorale arteery mentre lesioni aterosclerotiche sono stati generati dalla somministrazione di una dieta aterogenica a topi apoE-carente.
Le lesioni sono stati esaminati utilizzando OPT imaging emissione autofluorescenti seguita da istologica complementari e analisi immunoistochimica. OPT lesioni chiaramente distinti dalla parete vascolare sottostante. Dimensione della lesione è stato calcolato in sezioni 2-dimensionali utilizzando planimetria, consentendo calcolo del volume lesione e massima area della sezione trasversale. I dati generati usando OPT erano coerenti con misure ottenute con istologia, confermando l'accuratezza della tecnica e il suo potenziale come complemento (piuttosto che alternative) ai tradizionali metodi di analisi.
Questo lavoro dimostra il potenziale di OPT per l'imaging aterosclerotiche e neointimale lesioni. Esso fornisce un rapido, tanto necessario ex vivo tecnica per la routine quantificazione 3-dimensionale del rimodellamento vascolare.
La formazione delle lesioni arteriose è centrale per la morbilità e la mortalità associata a malattie cardiovascolari 1. Formazione della lesione è considerata essere causata da una risposta infiammatoria illimitato arteriosa lesioni 2. Le lesioni aterosclerotiche si formano lentamente in risposta al danno cronico alla parete arteriosa mentre le lesioni restenotici sviluppano rapidamente dopo danni meccanici acuta (ad esempio, dopo l'impianto di stent). I meccanismi che contribuiscono allo sviluppo di lesioni arteriose sono stati chiariti considerevolmente l'uso di modelli animali, spesso in combinazione con relative manipolazioni genetiche 1.
Analisi della dimensione della lesione e la composizione ha classicamente dipendeva pesantemente ex vivo, istologia 2-dimensionale (anche se questo sta cambiando con lo sviluppo di metodi perfezionati per in vivo ed ex vivo rilevazione e l'analisi delle lesioni nei piccoli animali <sup> 3). L'analisi istologica delle lesioni arteriose è laborioso, che richiede tempo e fornisce informazioni limitate di struttura 3-dimensionale. Ad esempio, lesione onere è comunemente valutata misurando l'area della sezione trasversale di una lesione (sia in siti selezionati casualmente o al sito di massima occlusione). Ciò fornisce un'analisi incompleta di oneri complessivi lesione. Tutto il montaggio tecnologia di imaging dimensionale 3 fornisce una possibile soluzione a questo problema, ma sorprendentemente alcuni approcci adatti sono stati descritti. Ciò può essere dovuto prevalentemente alla dimensione delle arterie topo che sono troppo grandi per singoli fotoni microscopia confocale ma troppo piccolo per risonanza magnetica (MRI) 4 e X-ray tomografia computerizzata (CT) 5. Applicazione di ex vivo MRI e micro CT allo studio delle lesioni aterosclerotiche nei topi suggerisce offrono risoluzione limitata, anche relativamente grandi arterie. In aggiunta a questo, i tempi di acquisizione relativamente lungo necessariolimitare la velocità (e aumentare i costi di scansione) 4,6.
Lo sviluppo di nuove modalità di imaging ottico (come tomografia a coerenza ottica 3,7 e foto-acustica tomografia 8) offre molto potenziale per migliorare l'imaging delle lesioni nelle arterie murini. Potenziale simile è dimostrato dal tomografia ottica di proiezione (OPT) che è stato sviluppato per consentire l'analisi di embrioni di topo. OPT è stato progettato per campioni immagine vanno da ~ 0,3-10 mm di diametro 9. Trasmissione di imaging registra l'opacità di un campione semi-trasparente a luce visibile e policromatica, può essere utilizzato per l'identificazione delle strutture anatomiche. Emission record di imaging emissione di luce a lunghezze d'onda di eccitazione seguenti specifiche dal endogena (ad esempio, collagene, elastina) e fluorofori esogene nel campione. Questo può anche fornire informazioni anatomiche (poiché diversi componenti del tessuto possono differire per il tipo e la densità delle specie autofluorescentipresente). Inoltre, la distribuzione di immunoreattività o espressione genica può essere determinata con l'impiego di opportune sonde fluorescenti 10. Per entrambe le modalità di imaging (trasmissione o emissione), luce viene focalizzata su un dispositivo ad accoppiamento di carica per consentire la cattura delle immagini iterativo durante la rotazione del campione (solitamente 400 immagini a incrementi di 0,9 °). Questi possono essere usati per il calcolo dei volumi da metodi di ricostruzione tomografica standard (come filtrato retroproiezione (utilizzando un algoritmo cono) o la ricostruzione iterativo).
Questo video dimostra la nostra nuova applicazione di optare per un rapido, quantificabile e conveniente analisi 3-dimensionale delle lesioni aterosclerotiche e neointimale, come descritto in precedenza in Kirkby et al. 11. La tecnica ha dimostrato di essere adatto per quantificare le dimensioni della lesione in tre modelli di uso comune: (i) femorale filo-infortunio; (Ii) legatura dell'arteria femorale, e (iii) aterosclerosi indotta dalla dieta in apolipoprotein E carente (apoE – / – mice).
Analisi 3 dimensioni ha un grande potenziale per la sostituzione o aggiunta alle tecniche istologiche 2-dimensionali che ancora stanno alla base della maggior parte delle ricerche di formazione della lesione arteriosa. Qui OPT è mostrato in piccole arterie murini (con le arterie femorali murini probabilmente rappresentano i piccoli vasi che possono essere analizzati con successo utilizzando questa tecnica). È, tuttavia, anche adatto per l'uso con le arterie (e lesioni) da altre specie, incluse le navi umane piccole e medie dimensioni; il nostro gruppo ha utilizzato con successo la tecnica per analizzare lesioni dell'aorta di coniglio (Bezuidenhout et al;. inedito). OPT promette analisi veloce e maggiore informazione strutturale rispetto istologia tradizionale e ha il vantaggio di non impedire successiva analisi del campione utilizzando tecniche sia istologiche e immunoistochimiche.
Le immagini prodotte con OPT dato dettaglio anatomico, mostrando luoghi di formazione della lesionee la dimensione delle lesioni in queste aree. Le arterie utilizzati in questi studi sono probabilmente vicino al limite di risoluzione per la tecnica e la qualità dell'immagine è quindi ridotta in una certa misura da artefatti (probabilmente derivanti da disallineamento di rotazione, compensazione incomplete, riflessione / rifrazione ai vertici agarosio e problemi di messa a fuoco) . Nonostante ciò, i dati richiesti (cioè, gli strati della parete del vaso) rimangono distinguibile e quindi la tecnica è estremamente utile per la quantificazione dei singoli strati. Infatti, le immagini potrebbero essere quantificati rapidamente e riproducibile per fornire misure di lesione e il volume del lume nelle sezioni reggitarga della nave, così come aree di sezione trasversale della lesione e lume a siti selezionati nel campione. Grande (aorta) e medie imprese (femorale, carotide, succlavia) arterie murine – quelle generalmente utilizzate per l'analisi della formazione lesione aterosclerotica e neotintimal nei topi – sono stati con successoanalizzate con questo metodo. Anzi ora abbiamo utilizzato OPT per dimostrare l'effetto di interventi farmacologici e manipolazione genetica su dimensione della lesione aterosclerotica e neointimale. Ad esempio, il blocco del recettore dell'endotelina alterato neointimale formazione della lesione, mentre l'eliminazione selettiva del recettore dell'endotelina B dal endotelio vascolare no 15. In aterosclerosi topi inclini, delezione genetica degli enzimi 11β-HSD1 16 o galectina 3 17 hanno mostrato di ridurre le dimensioni delle lesioni aterosclerotiche.
La quantificazione del volume della lesione è un vantaggio evidente di OPT. Dà un'indicazione più informativo del carico totale della lesione in un'arteria 4 che di solito è ottenuto con metodi istologici. Analizzando l'intera lesione riduce bias di selezione ed errori che inevitabilmente si verificano quando le sezioni discreti di una nave sono scelti per l'analisi. Produzione di profili longitudinali lesione è un'ulteriore forza di OPT, Sottolineato dal confronto delle lesioni indotte da diversi tipi di lesioni 13,16 (Figura 5). Ad esempio, sia la legatura completa e filo-inserimento indotta un'occlusione quasi totale in prossimità della biforcazione femero-popliteo. Lesioni Wire, lesioni tuttavia, prodotti che estese lungo tutta la lunghezza della sezione scansionata, mentre le lesioni indotte da legatura arteriosa rapidamente rimpicciolita e scompaiono. Questo modello è coerente con la misura maggiore di lesioni provocate da inserimento del filo guida per angioplastica. Generazione risultati simili utilizzando sezioni istologiche è costosa, richiede tempo e manodopera.
I vantaggi di OPT includono la qualità delle immagini che produce e la sua velocità relativa e semplicità (abbiamo routinariamente digitalizzata 20 navi al giorno). La qualità dell'immagine appare superiore, o almeno comparabili, ad altri metodi per la generazione di immagini 3-dimensionale ex vivo (ad esempio MRI e CT micro-), yet OPT richiede tempi di scansione più brevi (tempo di integrazione per i nostri studi era tipicamente 1-2sec / immagine) ed è meno costoso. Preparazione del campione si estende per diversi giorni, ma richiede poca fatica, i vasi possono essere preparati in lotti, ed i dati possono essere acquisiti in un'unica sessione. Di conseguenza, la velocità è elevata e non richiede l'uso esteso dello scanner. È importante sottolineare che la natura non distruttiva di OPT significa che può essere utilizzato per identificare i siti di interesse per l'esame immunoistochimico; riducendo così la quantità di taglio e colorazione desiderata. E 'possibile che lo sviluppo di alta risoluzione ultrasuoni fornirà un metodo alternativo per la quantificazione volumetrica delle lesioni in arterie questo formato, ma gli autori sono a conoscenza di pubblicazioni che dimostrano questa applicazione.
Forse non sorprende, la qualità delle immagini in OPT è inferiore a tecniche microscopiche (che possono, naturalmente, essere svolti solo su campioni più piccoli). Perfezionamenti proposti a reconstruction di dati può risolvere questa limitazione permettendo futuro miglioramento della qualità dell'immagine 19,20. Un'altra preoccupazione metodologica è che il trattamento dei tessuti altera le caratteristiche del campione. Ad esempio la natura lipofila dell'agente di compensazione, alcool benzilico / benzil benzoato (BABB), è probabile rimuovere lipidi da lesioni aterosclerotiche, mentre prima la disidratazione può causare restringimento (anche se, naturalmente, disidratazione e rimozione dei lipidi passaggi sono anche una caratteristica di preparazione del campione per l'incorporamento in paraffina). BABB stato usato in questa inchiesta, in confronto con gli agenti di compensazione idrofili (ad esempio glicerolo 21) provoca solo piccole variazioni di morfologia.
Ci sono diverse possibilità per un ulteriore sviluppo e perfezionamento di OPT, con particolare riferimento al monitoraggio della disposizione 3 dimensioni di cellule chiave e fattori coinvolti nel rimodellamento arterioso segnalazione. La forte autofluorescenza di tessuto arterioso, che è talen vantaggio nella generazione di immagini anatomiche, non si spegne con i metodi esistenti di sbianca 22 e può limitare l'uso di sonde fluorescenti per valutare modelli di RNA e proteine distribuzione. L'uso di sonde colorimetrici (ad esempio β-galattosidasi) individuate tramite tomografia trasmissione può superare questa limitazione.
Per concludere, OPT ha un grande potenziale per l'imaging 3 dimensioni delle lesioni nell'intima delle arterie murini. Essa rappresenta un notevole progresso sui metodi 2 dimensioni, che sono generalmente alta intensità di manodopera e non rappresentano in modo efficace il volume totale della lesione. OPT è relativamente veloce, conveniente e non distruttiva. Nuove costruzioni in analisi dell'immagine promettono di aumentare ulteriormente la potenza e l'utilità della tecnica.
The authors have nothing to disclose.
Questo lavoro è stato sostenuto da borse di studio presso l'Università di Edimburgo (NSK) e Carnegie Trust (LL; Henry schema Dryerre) e finanziamenti dalla British Heart Foundation (PWFH, BRW, DJW; RG / 05/008; PG / 05/007; PG / 08/068/25461) e Wellcome Trust (JRS, BRW, DJW; 08314 / Z / 07 / Z). Gli autori sono grati a sostenere per il loro lavoro forniti dal Centro di ricerca di eccellenza premio BHF-finanziato al Centro for Cardiovascular Science.
Gli autori sono particolarmente grati per la consulenza del professor Masataka Sata (Università di Tokushima) e il dottor Igor Chersehnev (in gruppo Dr Ernane Reis 'al Mount Sinai School of Medicine) sull'istituzione dei modelli chirurgici di produzione neointimale lesione. Il video è prodotto e messo a disposizione dalla Sata et al. (Http://plaza.umin.ac.jp/~msata/english.htm) è stato particolarmente utile.
Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
Operating Microscope | Zeiss, Germany | N/A | OPMI Pico i |
Anaesthetic Machine | Vet Tech, UK | N/A | |
Fluovac | Harvard Apparatus UK | 340387 | |
Fluosorber | Harvard Apparatus UK | 340415 | |
Bead Steriliser | Fine Science Tools, UK | 1800-45 | |
Heated Mat | Fine Sceince Tools, UK | 21061-10 | |
Balance | Mettler Toledo | MS1602S | PB1502 or equivalent |
Sutures | Ethicon, UK | 5/0 Mersilk | |
Guidewire | Cook Inc, USA | C-PMS-251 | 0.014” |
Suture Silk | Fine Science Tools, UK | 18020-60 | 6/0 Mersilk |
Surgical Tools | Fine Science Tools, UK | 14058-09 | Toughcut Iris scissors |
15000-01 | Cohan-Vannas Spring Scissors | ||
11251-35 | Dumont #5/45 Forceps | ||
11370-31 | Moria Iris Forceps | ||
13008-12 | Halsted-Mosquito Haemostat | ||
18050-35 | Bulldog clips | ||
Bioptonics 3001 Tomograph | Bioptonics, UK | N/A | |
Magnetic OPT Mount | Bioptonics, UK | N/A | |
Computer | Dell Inc, UK | N/A | |
Peristaltic pump | Gilson | F117606 | Minipuls 3 |
DataViewer software | Skyscan, Belgium | v.1.4.4 | |
NRecon software | Skyscan, Belgium | v.1.6.8 | |
CTan software | Skyscan, Belgium | v.1.12 | |
Isoflurane | Merial Animal Health Ltd, UK | AP/Drugs/220/96 | 100% Inhalation vapour, liquid |
Medical Oxygen | BOC Medical, UK | UN1072 | |
Vetergesic | Alstoe Animal Health Ltd, UK | N/A | 0.3mg/ml |
1% Lignocaine | Hamlen Pharmaceuticals, UK | LD1010 | 10ml ampoule |
EMLA Cream | Astra Zeneca, UK | N/A | |
Sodium Pentobarbital | Ceva Animal Health Ltd, UK | N/A | |
Western Diet | Research Diets, USA | D12079B | 0.2% cholesterol |
Phosphate Buffered Saline | Sigma UK | P4417 | |
Heparin (Mucous) | Leo Laboratories, UK | PL0043/003GR | 25, 0000 Units |
Neutral Buffered Formalin | Sigma, UK | HT501128 | 10% |
Ethanol | VWR BDH Prolabo, UK | 20821.33 | Absolute AnalaR |
Agarose | Invitrogen, UK | 16020050 | Low melting point |
Filter Paper | GE Healthcare, UK | 113v | Whatman |
Cyanoacrylate adhesive | Henkel, UK | 4304 | Loctite |
Benzyl alcohol | Sigma, UK | B6630 | |
Benzyl benzoate | Sigma, UK | 402834 | |
Methanol | VWR BDH Prolabo, UK | 20856.296 | 100% |