ここ半無傷でモータ出力の変化(筋収縮)を監視しながら、我々は運動神経活動のoptogenetic操作のためのプロトコルを記述<em>ショウジョウバエ</em従来の共焦点顕微鏡内にレーザーを使用して>幼虫。この技術は、モータ回路のダイナミクスを解明するために、いくつかのneuromeresにおける神経活動の局所摂動を達成するために研究者を可能にします。
ショウジョウバエ幼虫の運動は、回路1-6基礎となる神経細胞の成分の遺伝アクセシビリティーのおかげで、発達と生理的神経科学の素晴らしいモデルシステムです。幼虫の神経回路における光遺伝学7,8の適用は、私たちが空間的かつ時間的にパターン化された方法は9-13に神経活動を操作することができます。典型的には、試験片を広く水銀ランプで照明またはLEDので、ターゲットニューロンの特異性は、例えばたGal4-UAS装置14,15などのバイナリ遺伝子発現系によって制御されている。本研究では、 "サブ遺伝解像度"に空間分解能を向上させるために、我々は、ローカルで、従来の共焦点顕微鏡で実装レーザーを使用して腹側神経索のニューロンのサブセットを点灯。半無傷の幼虫の体壁の動きを監視している間、私たちは、対話的にアクティブ化またはチャネルロドプシン16,17 Oと神経活動を抑制したそれぞれRハロロドプシン18-20、。神経組織の空間的かつ時間的に制限された照明により、我々は行動の特定の段階で回路内の特定の神経細胞の活動を操作することができます。この方法では、腹側神経索とモータ出力の時空間パターンにおける局所神経アセンブリの活動との関係を研究するために有用です。
ショウジョウバエの幼虫でフォワード蠕動運動は、前のセグメントの後方から筋収縮の伝播によって生じる。この運動は、長手方向の体軸に沿って腹神経索内で運動ニューロンの逐次的活性化によって実現される。このパターン化された伝播の活動の背後にある回路を調べるには、神経活動の局所摂動は有益なアプローチである可能性があります。薬理アッセイは神経組織でこのような神経伝達物質などの特定物質を、制御することができますが、幼虫の腹側神経索が縦軸に沿って似neuromeres成る反復構造であるため、薬理薬の効果は、ほぼすべてのセグメントの中で同じようなことができます。あるいは、一つのセグメントの少数のoptogeneticまたは温度感受性プローブ分子を発現することができる。しかしながら、このような特定のGAL4線を生成することは非常に困難である。ここで我々はいくつかのセグメントにニューロンを操作するための方法を提示レーザ照明を用いメンツ。共焦点顕微鏡における空間的に閉じ込められた照明の利点生かし、1は、ローカルエリアのニューロンの活動を混乱させることができます。ニューロン特異GAL4行のサブセットによってプローブの発現パターンと組み合わせることで、このレーザー照射法が大幅に摂動のために空間分解能を向上させます。この方法は唯一、従来の共焦点顕微鏡を必要とするためと、追加の実験装置の購入は通常必要ありません。
この手法を用いて、モータ出力13の伝搬時のモータ神経活動の役割を調べた。蠕動運動中にいくつかのセグメント内の運動ニューロンの活動を遮断することによって、我々は、運動ニューロン自体の活性はモータ出力信号の伝播のために必要とされるかどうかをテストすることができた。運動ニューロンのローカルおよび過渡封鎖は蠕動運動の伝播を逮捕した。封鎖は、プロを除去した後pagationは波が逮捕されたセグメントに現れた。この現象は、モータニューロンの活性化せず、伝播波が腹神経索に沿ってそれ以上進行しないことを示唆し、従って、運動ニューロンの活性化は、蠕動運動が必要である。我々は以前稲田ら (2011)13に詳細なデータと、この現象についての議論を報告している。ここでは、解剖幼虫の動きを監視しながら、インタラクティブに神経活動を混乱させる方法について説明します。さまざまなGAL4ラインと活動操作のための時空間パターンのシリーズを使用して、1つはモータ回路の摂動応答特性を通して回路ロジックを調べることができます。
神経活動の時間的局所摂動は、神経回路網のダイナミクスを分析するための貴重なテクニックです。このプロトコルでは、レーザーを用いて光遺伝学によって神経活動を操作する手法を提案する。レーザーの高い方向性は水銀やキセノンランプを用いた広視野刺激よりもローカライズoptogenetic刺激を可能にします。レーザ照明が既に以前の研究で光遺伝学に適用されてきたが、ガラス繊維、マイクロマニピュレーター、レーザ光源などの特殊な設定は、ほとんどの先行研究で必要とされる。このプロトコルでは、我々は地元の照明のために、従来の共焦点顕微鏡を使用しています。共焦点顕微鏡システムが広く使用されているので、この方法は、多くのラボで高解像度の光遺伝学を適用する機会を開く。
幼虫の解剖とレーザーパワー:プロトコルは、2つの重要なポイントがあります。まず、脳、腹側神経索や運動神経はドゥリが破損している場合ngの解剖、幼虫は以下またはnone自発蠕動運動を示すであろう。精密スプリングはさみで背側に切り込みを作り、鉗子で内臓を取り外す場合は特に、不可欠です。解剖の詳細は以前に報告されている21。第二に、もし十分な刺激は、約0.1のレーザパワー〜ChR2をNpHR又は1〜10mWのための/ mm 2でが要求されるための1 mWの/ mm 2で達成されるべきである。我々は、照明のおおよその面積で割った対物レンズ下の総光パワーのレーザパワーを評価した。我々は、パワー·メータ(mobiken、三和MIテクノス、日本)を用いてトータル光パワーを測定した。私たちは、円形の定数倍とほぼ回折限界の照明領域を与えるレーザーの波長の2乗を照明の面積を推定した。試料上の有効な照明の電力は、走査速度およびしびれを変化させることにより、レーザの出力パワーによるものだけを調整することができるが、繰り返しのER。我々は63回20-100μ秒/ピクセルでレーザーをスキャンしました。また、光遺伝学蛋白質及びATRの量の発現レベルはまた、刺激効率のために重要である。従って、幼虫はないoptogenetic応答を示さなかった場合は、以下の点をチェックし、修正すべき:1)レーザパワー(顕微鏡システムを最適化することにより)、2)光遺伝学タンパク質の発現レベル(遺伝子型および飼育温度をチェックすることにより)、及び3)量ATR(ATR、供給期間の濃度を調整することにより)。 NpHR 13未知の理由により、ChR2を行いよりATRの高い濃度を必要とします。 ChR2をここで説明するよりも低いATR( 例えば 0.1 mm)を(1 mM)を含む食品で飼育幼虫でうまく動作します。 1ミリメートルATRに幼生を供給すると、ChR2を光反応を行うために十分であるとして、我々はChR2を実験で最初の裁判のため、この濃度をお勧めします。 ATRの濃度は、その後、1 mMのから降りて滴定することができます。 ATRの露光期間と同様に、私たちはお勧め期間は堅牢optogenetic制御のため、ここで説明。私たちはしばしば、短い期間ATRに幼生を供給する際にoptogenetic応答を観察することができませんでした。
このプロトコルでは、レーザ照明および画像取得が別のコンピュータによって操作される。したがって、CCDカメラによるレーザ照射の時空間パターンを明確に検出、データ解析のために重要である。レーザスポット又はラインはCCDイメージに暗い場合には、ハロゲンランプと体壁を可視保ちながらレーザー照射を視覚化するCCDカメラのゲイン値のパワーを最適化する必要があります。
このプロトコルで示さ時空照明が幼虫のモーター回路に関する情報を提供しますが、方法はいくつかの制限があります。 "空間"の態様としては、照明の位置は、体壁の動きをビデオテープに録画に使用される低倍率のCCDイメージによって記録される。これにより、照射領域は、セグメント·レベルではなく、細胞レベルで割り当てることができる。 "tまでのようにemporal "の態様では、レーザーによる共焦点顕微鏡照明によりレーザ走査スイッチオン時間差は、共焦点顕微鏡システムとスキャン条件に依存するので、試行錯誤によっていくつかのテストは、照明タイミングを調整する必要がある。照射のタイミングにできるので、 ImageJのような適切なソフトウェアを使用してCCDイメージムービーで決定することが、時間分解能の重要な要因は、CCDカメラ画像のフレームレートです。我々は通常、毎秒7.5から15フレームのフレームレートを設定します。
optogeneticツールの進歩は、私たちは、このプロトコルを修正する機会を提供します。我々は第 3齢幼虫OK6-Gal4のを有するとUAS-ChR2を[H134R]またはUAS-NpHR2を使用していました。その他optogeneticツールの代わりにChR2を[H134R]またはNpHR2などChR2を[T159C/E123T]、NpHR3またはアーチがアクティビティコントロール22の効率を高めることができますように。加えて、他のGAL4線を使用したり、他の発達段階に分析することで、モータcircuiに関する詳細情報を提供することができるTS。
このプロトコルでは、運動活性をCCDカメラでbodywall収縮の透過画像でモニターした。 ChR2をまたはNpHRで神経活動を操作しながら、カルシウム感受性蛍光分子( 例えば GCaMP)と運動ニューロンの活性を直接監視することができます。この場合には、広域かつ高感度CCDカメラ( 例えば、カメラEMCCD)で青色光照明はハロゲンランプの代わりに用い、通常のCCDカメラが以前に本明細書に記載されている。低倍率の対物レンズによる試料と監視bodywall上方から高倍率の対物レンズ(40倍など )による腹神経索の照明:追加の対物レンズを用いて、bodywallの動きを監視しながら、刺激の空間分解能を向上させるためには、より高度な方法とすることができる( 例えば 4倍)サンプルの下。この二重レンズ系は、私たちは、より高い空間分解能で神経系を刺激することを可能にする。
<p class="jove_content">ここに示されているプロトコルは、他の神経回路に適用することができる、未optogeneticツールは、神経系で表現することができ、十分な光が神経組織に送達することができる製剤を確立することができる。The authors have nothing to disclose.
この作品は、革新的な領域研究費補助金によってサポートされていました "メゾスコピックNeurocircuitry"(番号22115002)と文部科学省の "総合的な脳科学のネットワーク"(第221S0003)技術、日本と補助金日本学術振興会の若手研究(B)(番号21700344)(日本学術振興会)にHK
Name | Company | Catalog Number | Comments |
BX61WI Microscope | Olympus Corporation | BX61WI | |
Fluoview FV1000 confocal system | Olympus Corporation | FV1000 | |
CCD camera | Sony | XCD-V60 | |
all-trans retinal | Sigma | R2500-500MG | 200 mM stock in 95% EtOH |
Silpot184 | Dow Corning Toray | 3255981 |