TruTip простой технологии нуклеиновых кислот посредством чего извлечение пористой монолитной связывания матрицы вставляется в наконечник пипетки. Таким образом, формат подготовки образца совместим с большинством ликвидных инструментов обработки, и могут быть использованы для многих средней и высокой пропускной клинического применения и типов образцов.
TruTip простой технологии нуклеиновых кислот посредством чего извлечение пористой монолитной связывания матрицы вставляется в наконечник пипетки. Геометрия монолита могут быть адаптированы для конкретных наконечники начиная объемом от 1,0 до 5,0 мл. Большой пористостью монолита позволяет вязких или сложные образцы легко проходить через него с минимальными жидкостный противодавления. Двунаправленный поток максимизирует время пребывания между монолитом и образец, и обеспечивает большие объемы образцов, подлежащих обработке в пределах одной TruTip. Основные шаги, независимо от объема образца или TruTip геометрии, включают лизиса клеток, нуклеиновые кислоты связывания с внутренней поры TruTip монолит, смывая несвязанных компонентов образца и лизис буфера, и элюирование очищенного и концентрируют нуклеиновых кислот в соответствующем буфере. Атрибуты и адаптивность TruTip демонстрируются в трех автоматизированных клиническом образце обработки протоколов, использующих epMotion Эппендорф 5070, Гамильтон звезда и STARPLUS жидких роботов обработки, в том числе выделение РНК из носоглотки аспирации, изоляции геномной ДНК из цельной крови и выделения ДНК плода и обогащение из больших объемов материнской плазме (соответственно).
Очистка нуклеиновых кислот необходимо для большинства молекулярной диагностики, исследований использования, и научных приложений жизни. Различные подходы появились с момента фенол / хлороформом, многие из которых основаны на фундаментальном принципе нуклеиновой кислоты связывания с диоксидом кремния в присутствии хаотропные соли 1. Процесс экстракции был упрощен и автоматизирован за счет использования различных бисером и мембранные форматов, со спином фильтры, магнитные шарики и связанных с ними подходов доминирующей отрасли науки о жизни (см. примеры в 2-13). В то время как эффективные, частицы и мембраны известные ограничения при столкновении со сложными клиническими матриц. Например, мембраны и шарик на основе столбцы соответствуют, имеют небольшие размеры пор (таким образом, высокое давление назад), а также требуют некоторого типа поддержки для того, чтобы быть обработана с помощью системы центрифуги или вакуума. Физические характеристики мембран и шарик результате столбцовзначительного жидкостного сопротивление, которое ограничивает тип образцов, которые могут быть эффективно обработаны без засорения расходные, и / или общее (вход) объем образца, который может быть одно-направленно обрабатываются через пути потока. С другой стороны, магнитные частицы должны быть распределены по всему образцу при перемешивании. Необходимость гомогенно распределять магнитные частицы в растворе ограничивает объем входной выборки, которые могут быть обработаны с наиболее магнитный валик расходных материалов. Клинические признаки образца (такие как вязкость и сложности) может привести к неэффективному концентрации магнитных частиц на стороне трубки или стержня. Кроме того, мелкие частицы кремнезема может разорвать из бисера в процессе извлечения, теряя свою намагниченность и загрязнения конечного образца.
Технологии TruTip была разработана для преодоления некоторых из этих нуклеиновых кислот обработки образцов ограничений и ограничений 14. По вложения пористый монолит впипетки, жидкостный противодавление снижается, что позволяет управление потоком с помощью вакуума (т.е. стремление пипетки). Эта функция позволяет процесс добычи и Инструменты требующегося, чтобы очистить нуклеиновых кислот из сложных видов образцов значительно упростить (рис. 1). Геометрии и пористость монолита предназначена для минимизации засорения, а толщина монолита обеспечивает достаточную нуклеиновой кислоты связывающей способности для образца объемом от 1,0 до 5,0 мл. Двунаправленный поток во время аспирации и дозирования образца позволяет в течение длительного времени пребывания между экстрактом образца и связывания монолит для эффективного восстановления нуклеиновые кислоты и элюирования и обеспечивает относительно большие объемы образцов, подлежащих обработке, которые превышают объем емкости наконечник пипетки непосредственно. Ранее мы сообщили о разработке и применении процедуры ручной очистки TruTip гриппа РНК из носоглотки образцов с использованием одно-или многоканальные Райнин пипетки 15. Эквивалентная эффективность добычи были получены между автоматизированными QIAcube и методы руководства TruTip 10 6 копий генов гриппа на мл аспирата носоглотки. Целью данного исследования было продемонстрировать средней и высокой пропускной способностью, автоматизированные TruTip нуклеиновой кислоты процедур очистки носоглотки аспирация (НПД) и других клинически значимых типов образцов, с использованием жидких роботов обработки обычно встречаются в ссылки клинических лабораторий.
Простота концепции TruTip и рабочий процесс (рис. 1) сделать его легко адаптировать, автоматизировать, эффективной и действенной для ряда клинических образцов матриц, объемы входной выборки, и жидких систем обработки. Следует признать, однако, что каждый клинический образец является уникальным, и будет меняться одного к другому в вязкости, частиц, слизи, поверхностных загрязнений, микробного и / или человеческого генетического фона. Учитывая ожидаемые изменения в области клинической состав образца и предполагаемое использование автоматизированный протокол пробоподготовки TruTip, поэтому может возникнуть необходимость в изменении определенные шаги в TruTip процедуры для достижения желаемых результатов для определенного типа образца. Независимо от типа образца, однако, TruTip параметров, которые обычно имеют наибольшее влияние на чистоту нуклеиновых кислот и / или восстановления включают:
Поскольку геометрия, пипетки материала и способа крепления к роботизированных рук канала являются уникальными для каждого изготовителя прибора, различные конструкции TruTip требуется для каждой системы обработки жидкости. TruTip монолит размеры (диаметр, толщина и размер пор) коррелируют с нуклеиновой кислотой, связывающую способность (при элюировании эффективности), как ожидается для любого твердофазной экстракции техники. В то время как толстый (> 4 мм) матрицы могут быть встроены в 1 мл TruTip увеличить нуклеиновой кислоты связывающей способности для больших объемов образцов и / или выравнивания способность к связыванию через специальные форматы TruTip, существует компромисс между толщиной TruTip и скорости потока при начальные стадии связывания (в присутствии сырой лизатов). Таким образом, иногда выгодно, чтобы встроить большего диаметра монолитов в больших объемах наконечники на начальных этапах автоматизированного протокола, (например, </ EM> Гамильтон 5 мл / Akonni TruTips для больших объемов экстракции). С учетом конкретных конфигураций TruTip продиктовано производителей жидкость роботов обработки, однако, не обязательно ожидать TruTip нуклеиновые кислоты выход идентичными через жидкость платформы обработки различных производителей или разных размеров TruTip.
Клинических образцов (по определению) будет содержать значительное количество геномной ДНК человека, если они не получены из стерильных в норме сайтов (например, спинномозговой жидкости). Иногда геномной ДНК человека нужен (как показано на рисунке 6), тогда как в других приложениях ДНК человека представляет собой нежелательный фон геномной (как рисунок 5). Присутствии фонового ДНК, как правило, не является проблемой, пока общее количество нуклеиновой кислоты в образце, не превышает способность к связыванию монолита, а фон ДНК может служить в качестве носителя, если желаемый целевой нуклеиновойкислота присутствует в следовых количествах. Целью большого объема плазмы протокола экстракции (рис. 7), чтобы изолировать (фрагментированные) ДНК плода в присутствии 10-20 кратного избытка материнской ДНК, которая похожа на цель пробоподготовки инфекционных заболеваний Тесты исключением того, что последовательностей очень конгруэнтно и может быть отличаются высокой специфичностью молекулярного тестирования и / или размер дискриминации. В этом случае общий циркулирующей ДНК выделяли с использованием 5 мл TruTip и последующее высокомолекулярный и низкомолекулярный ДНК плода разделены посредством последующего связывания и элюирования 1 мл TruTip, изменяя условия связывания буфера. Селективное разделение размер и обогащение нуклеиновых кислот-мишеней на основе их связывание и элюирование свойства монолита, является существенно различным механизмом действия, чем достигается за счет мембраны или размер колонки исключение спина. Разделение Размер и обогащение микробной ДНК из геномной ДНК человека может бытьccomplished в будущих приложений через настройки связывания TruTip и элюирования буферов.
Автоматизированные протоколы продемонстрировали здесь подчеркнуть полезность TruTip монолит сам для обработки разнообразных клинических образцов, и как она может быть адаптирована для больших объемов и конкретных жидких роботов обращения. Обтекаемый методы обычно приводят к более быстрому добычи протоколов по сравнению с другими автоматизированными системами. Простота TruTip технологии, однако, также предоставляет некоторые преимущества в стоимости для тех, кто заинтересован в покупке нового, автоматизированная система очистки нуклеиновых кислот, так как основной аппаратных средств, необходимых для автоматизации процедур TruTip пипетки руку сам канал, а не магнитные стержни, вакуумные системы или бортовой центрифуги. Используя предварительно заполненные пластинами реагента может также уменьшить пространство и необходимые расходные материалы, и в два раза пропускную за один запуск. Минимизация палубе пространство с протоколами TruTip также предоставляет продвинутым пользователям возможность интегрировать выше или Downstream автоматизированных процессов с TruTip. Например easyBlood решение Гамильтона для фракционирования цельной крови могут быть включены с автоматизированным способом экстракции TruTip, что значительно упрощать био-банковских процессов. Постэкстракционный процессами, такими как нуклеиновые кислоты количественно, нормализация, ПЦР установка, или секвенирование ДНК также легко интегрируется с TruTip на больших платформах наливных.
The authors have nothing to disclose.
Части этой работы были при поддержке Национального института здоровья (NIH) в рамках гранта R 44 AI072784. Мы благодарим доктора Кирстен Святого Георгия, Сара Б. Griesemer, Дэрил Lamson и Эми Дин лабораторией вирусных заболеваний, Уодсворта центр штата Нью-Йорк Министерство здравоохранения для количественно вирионы гриппа и доступ к клинически подтверждены гриппа в реальном времени ПЦР-анализ.
Reagent/Material | |||
TruTip Influenza Extraction Kit (EPM TruTips) | Akonni Biosystems, Inc. | 300-11120 | |
95% Ethanol | Acros Organics/ThermoFisher Scientific | AC615110040 | |
99% Acetone | Sigma-Aldrich | 270725-4L | |
DEPC-treated water | Life Technologies | AM9906 | |
Reagent Reservoir, 30 ml | Eppendorf | 960050100 | |
Deep well plate 96/2,000 μl | USA Scientific | 30502302 | |
epT.I.P.S. Motion Filtertips, 1,000 μl | Eppendorf | 960050100 | |
Equipment | |||
epMotion 5070 System | Eppendorf | 5070 000.000 | |
Dispensing tool TM1000-8 | 960001061 | ||
Reservoir rack | 960002148 | ||
Table 1. Reagents and equipment for automated RNA extraction from NPA. | |||
Reagent/Material | |||
TruTip gDNA Blood Extraction Kit (Hamilton TruTips) | Akonni Biosystems, Inc. | 300-20341 | |
95% ethanol | Acros Organics/ThermoFisher Scientific | AC615110040 | |
Proteinase K | AMRESCO LLC | E195 | |
1 ml Hamilton filtered CO-RE 96 tip rack | Hamilton Robotics, Inc. | 235905 | |
1 ml Hamilton non-filtered CO-RE 96 tip rack | Hamilton Robotics, Inc. | 235904 | |
50 ml Reagent Trough | Hamilton Robotics, Inc. | 187297 | |
Deep Well 2 ml plate | USA Scientific | 1896-2800 | |
Nunc 96 DWP-2 ml | Thermofisher | 27874 | |
Reagent Trough | Fisher | 14-222-412 | |
Equipment | |||
Hamilton STAR System | Hamilton Robotics, Inc. | 173027 | |
1 ml Independent Pipette Channels / Modular Arm | Hamilton Robotics, Inc. | 173081/173050 | |
1 ml 96-channel head | Hamilton Robotics, Inc. | 199090 | |
Tip Carriers | Hamilton Robotics, Inc. | 182085 | |
Sample Carriers/Inserts | Hamilton Robotics, Inc. | 173400/182238 | |
Plate Carriers | Hamilton Robotics, Inc. | 182090 | |
Multiflex Carrier | Hamilton Robotics, Inc. | 188039 | |
HHS2 Heater Shaker Unit | Hamilton Robotics, Inc. | 199033 | |
Rack Carrier | Hamilton Robotics, Inc. | 188047 | |
Table 2. Regents and equipment for 96-well genomic DNA extraction from whole blood. | |||
Reagent/Material | |||
TruTip R+D Circulating DNA Extraction Kit (Hamilton TruTips) | Akonni Biosystems, Inc. | Call to inquire | |
100% ethanol | Sigma-Aldrich | 459828-1L | |
Isopropanol | Acros Organics/ThermoFisher Scientific | AC327270010 | |
Proteinase K | AMRESCO LLC | E195 | |
Filtered 4 ml Tips | Hamilton Robotics, Inc. | 184022 | |
Unfiltered 1 ml Tips | Hamilton Robotics, Inc. | 235939 | |
96-Deep Well Plates | USA Scientific | 1896-2800 | |
50 ml Conical Tubes | Corning/ThermoFisher Scientific | 05-526B | |
50 ml Reagent Troughs | Hamilton Robotics, Inc. | 187297 | |
120 ml Reagent Troughs | Hamilton Robotics, Inc. | 182703 | |
Large Volume 96-Pos Reagent Troughs | ThermoFisher Scientific | 14-222-412 | |
Equipment | |||
STARplus Autoload Workstation Base / Deck Module | Hamilton Robotics, Inc. | 173025/190012 | |
1 ml Independent Pipette Channels / Arm | Hamilton Robotics, Inc. | 173081/173052 | |
5 ml Independent Channel / Modular Arm | Hamilton Robotics, Inc. | 184090/173050 | |
Plate Carriers | Hamilton Robotics, Inc. | 182090 | |
Multiflex Carrier | Hamilton Robotics, Inc. | 188039 | |
Rack Carrier for 50 ml Reagent Troughs | Hamilton Robotics, Inc. | 188047 | |
120 ml Reagent trough carrier | Hamilton Robotics, Inc. | 185290 | |
Tip Carriers | Hamilton Robotics, Inc. | 182085 | |
50 ml Tube Carriers | Hamilton Robotics, Inc. | 182245 | |
24 Position Sample Carriers | Hamilton Robotics, Inc. | 173400 | |
32 Position Sample Carrier | Hamilton Robotics, Inc. | 173410 | |
Table 3. Reagents and equipment for large volume DNA extraction from plasma. |