Un<em> In vitro</em> Modelo para estudiar la heterogeneidad de diferenciación de los macrófagos humanos y polarización
Summary
Macrófagos derivados de monocitos son células importantes del sistema inmune innato. A continuación, describimos un fácil de utilizar<em> In vitro</em> Modelo para generar estas células. Uso de centrifugación en gradiente, el aislamiento negativa de la microesfera y las condiciones específicas de cultivo de células, los macrófagos derivados de los monocitos se pueden generar para los estudios fenotípicos y funcionales.
Abstract
Macrófagos derivados de monocitos representan un tipo de célula importante del sistema inmune innato. Los modelos de ratón que estudian la biología de los macrófagos sufren de las diferencias fenotípicas y funcionales entre los macrófagos derivados de monocitos murinos y humanos. Por lo tanto, aquí describimos un modelo in vitro para generar y estudiar los macrófagos humanos primarios. En pocas palabras, después de centrifugación en gradiente de densidad de sangre periférica extraída de una vena del antebrazo, los monocitos se aíslan a partir de células mononucleares de sangre periférica mediante el aislamiento del grano magnético negativo. Estos monocitos se cultivaron a continuación durante seis días en condiciones específicas para inducir diferentes tipos de diferenciación de los macrófagos o de polarización. El modelo es fácil de usar y evita los problemas causados por las diferencias de cada especie, entre el ratón y el hombre. Por otra parte, está más cerca de las condiciones in vivo que el uso de líneas celulares inmortalizadas. En conclusión, el modelo descrito aquí es adecuado para estudiar macrófagos dee biología, identificar mecanismos de la enfermedad y nuevas dianas terapéuticas. A pesar de que no sustituir completamente a los experimentos con animales o tejidos humanos obtenidos post mortem, el modelo descrito aquí permite la identificación y validación de los mecanismos de la enfermedad y dianas terapéuticas que pueden ser altamente relevantes para diversas enfermedades humanas.
Introduction
Macrófagos derivados de monocitos representan un importante componente celular del sistema inmune innato y contribuyen a muchos procesos inflamatorios agudos o crónicos 1. Los macrófagos juegan un papel importante en muchas enfermedades inflamatorias como la aterosclerosis o el cáncer 2. Los macrófagos muestran un alto grado de plasticidad y son capaces de asumir diferentes fenotipos dependiendo de la micromilieu locales 3. Por lo tanto, el estudio de la diferenciación de los macrófagos y la heterogeneidad es esencial para aumentar nuestro conocimiento de la fisiopatología de muchas enfermedades y para permitir la identificación de nuevas dianas terapéuticas y el desarrollo de terapias novedosas.
En muchos casos, los modelos murinos se utilizan para investigar la fisiopatología de las enfermedades específicas. Sin embargo, el estudio de la biología de los macrófagos utilizando modelos de ratón se acompaña de varios defectos: (1) La proporción de los números de subconjuntos de leucocitos (por ejemplo, monocitos y granulocitos) en peripheral sangre de los ratones o seres humanos difiere significativamente sugiriendo diferentes funciones de los monocitos en la fisiopatología murino y humano. (2) Existen diferencias sustanciales en la expresión génica entre los monocitos de sangre periférica murinos y humanos sugieren diferencias sustanciales en su función durante la salud y la enfermedad 4. (3) Un número de marcadores que se utilizan para identificar los monocitos murinos y macrófagos (F4/80, LyC, etc.) No existe en las células mieloides humanas, por lo que la transferencia de los resultados en modelos de ratón a la situación humana bastante difícil.
Por lo tanto, con el fin de aumentar nuestra comprensión de la diferenciación de los macrófagos y la heterogeneidad en la enfermedad humana, tenemos que hacer uso de modelos de trabajo con los macrófagos humanos. Por lo tanto, aquí describimos un modelo de generación de macrófagos primaria humana que es fácil de usar y permite el estudio de los macrófagos derivados de los monocitos humanos in vitro en diversas condiciones resultantes en diferentes macrófagos potipos vascularización. En varios estudios, hemos utilizado el modelo in vitro de los macrófagos derivados de los monocitos humanos primarios para analizar la biología de los macrófagos y su potencial relevancia para la aterosclerosis humana 5-7.
A pesar de que no sustituir completamente a los experimentos con animales o tejidos humanos obtenidos post mortem, el modelo descrito aquí permite la identificación y validación de los mecanismos de la enfermedad y dianas terapéuticas que pueden ser altamente relevantes para diversas enfermedades humanas.
Protocol
Representative Results
Discussion
Macrófagos derivados de monocitos representan el tipo de célula clave del sistema inmune innato. Juegan un papel importante en muchas enfermedades inflamatorias, incluyendo la aterosclerosis o el cáncer 2. Por lo tanto, el estudio de la biología de los macrófagos es esencial para aumentar nuestro conocimiento sobre la fisiopatología de muchas enfermedades y permitir el desarrollo de terapias novedosas.
Muchos estudios se aplican modelos de ratón que sobreexpresan o carecen …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos Wambsganss Nadine por su excelente asistencia técnica. Este trabajo fue apoyado por una beca de la Deutsche Forschungsgemeinschaft (GL599/1-1) y en parte por una subvención del Fondo de Innovación FRONTIER (Universidad de Heidelberg) al CAG
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| 50 ml centrifuge tube (sterile) | Fisher | 055398 | |
| D-PBS (1X), liquid (no calcium or magnesium) | Invitrogen | 14190-250 | |
| EDTA | Sigma | T9285 | |
| BSA | Sigma | A-8806 | |
| FCS | Invitrogen | ||
| EasySep Human Monocyte Enrichment Kit | StemCell Technologies | 19059 | |
| EasySep Magnet | StemCell Technologies | 18000 | |
| FACS tubes | Fisher | 352008 | |
| Macrophage-SFM (1X) | Invitrogen | 12065-074 | |
| Penicillin-streptomycin | Sigma | P-4458 | |
| Nutridoma-SP | Roche | 11011375001 | |
| human M-CSF 10 μg | Peprotech | 300-25 | |
| Cell Culture Plates 6-well | Fisher | 07-200-80 |
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