Kuş Embriyonik vestibülokoklear sinir İşitsel Elyaf seçici Aydınger
Summary
Burada sinir ve arka beyin işitsel akson liflerinin izleme seçici için erken civciv embriyo akustik ganglion içine floresan boya enjeksiyonu takiben mikrodiseksiyon tekniği tarif.
Abstract
Embriyonik civciv periferik ve santral gangliyon hücre projeksiyonlar çalışma için yaygın olarak kullanılan bir modeldir. Işitsel sisteminde, sekizinci kranial sinir olan işitsel akson seçici etiketleme merkezi işitme devre geliştirme çalışması artıracaktır. Iç kulakta birden duyu organları VIII.yy. sinirin 1. katkıda çünkü bu yaklaşım zordur. Ayrıca, güvenilir bir kuş VIII.yy. sinir içinde akson vestibüler gruplar karşısında işitsel ayırt işaretleyicileri tespit edilmesi henüz. Devreler oluşur önce duyu-uyarılmış yanıtlar mevcut değil gibi işitsel ve vestibüler yolları, erken embriyo işlevsel olarak ayırt edilemez. Merkezi projelendirme VIII.yy. sinir aksonlar bazı çalışmalar takip edilmiştir, ama işitsel akson etiketleme diğer VIII.yy. sinir bileşenler 2,3 dan etiketleme eşlik etti. Burada, seçici labe için akustik gangliyondan anterograd izleme için bir yöntem açıklanmaktadırGelişmekte VIII.yy. sinir içinde l işitsel aksonlar. İlk olarak, oksijenli yapay beyin omurilik sıvısına batırılmış bir 8 günlük civciv embriyo ön sefalik bölgede kısmi diseksiyon sonrası, koklear kanal anatomik işaretlemeler ile tanımlanır. Daha sonra, bir ince çekilmiş cam mikropipet akustik ganglion hücreleri bulunan kanal ve komşu bölge içine derin rodamin dekstran amin küçük bir miktar enjekte etmek için konumlandırılmıştır. Enjeksiyonu takiben otuz dakika içinde, işitsel aksonlar arka beyin içine merkezi izlenir ve daha sonra histolojik hazırlanmasını takiben canlandırılabilir. Bu yöntem, merkezi işitsel devre oluşumu periferik gelişimsel çalışmalar için kullanışlı bir araç sağlar.
Protocol
Representative Results
Discussion
VIII.yy. sinirin erken geliştirme çalışmaları nedeniyle birden çok farklı gangliyon kaynaklanan embriyonik aksonlar tanımada zorluk kısmen sınırlı kalmıştır. Çeşitli çalışmalar erken gelişimi sırasında işitsel ve vestibüler duyu hücre ve ganglion hücre kaderi rehberlik moleküler sinyaller, 5,11,12 araştırdı fakat merkezi innervasyon düzenleyen süreçler belirlenecek henüz. Az ilköğretim çekirdekler için projelendirme merkezi süreçleri hakkında bilinenler ise akustik ga…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar erken embriyonik dönemde piliç iç kulak anatomisi üzerine uzmanlık için görüntüleme teknikleri ve Dr Doris Wu ile öneri ve yardım için Dr Candace Hsieh teşekkür etmek istiyorum. Bu çalışma NSF IOS-0642346, NIH T32-DC010775, NIH T32-GM008620, NIH R01-DC010796 ve DOE GAANN P200A120165 tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| Polystyrene Weigh Dish | Fisher Scientific | 02-202-101 | |
| Petri Dish, 35 X 10 mm | Fisher Scientific | 50820644 | Use to make silicone dissection dish |
| Sylgard Silicone Elastomer Kit | World Precision Instruments | SYLG184 | Coat Petri to make dissection dish |
| Dissection Pins | Various | Holds embryo in place during dissection | |
| NaCL | Various | part of aCSF recipe | |
| KCl | Various | part of aCSF recipe | |
| KH2PO4 | Various | part of aCSF recipe | |
| NaHCO3 | Various | part of aCSF recipe | |
| Glucose | Various | part of aCSF recipe | |
| CaCl2 | Various | part of aCSF recipe | |
| MgSO4 | Various | part of aCSF recipe | |
| Container for aCSF. Suggest translucent wide-mouth Nalgene jar, 500 ml (16 oz) with lid. | CPLabSafety | QP-PLC-03717 | Drill hole opening in top of lid for glass bubling stem to penetrate liquid |
| Empty 5 ml glass vial or comparable transparent vial | American Pharmaceutical Partners, Inc | 6332300105 | Use during aCSF incubation to keep samples separate from each other and from the bubbling stream |
| Tank of carbogen (95%O2 / 5%CO2) connected by tubing to bubbler | Various | Attach by tubing to glass stem bubbler for infusion into aCSF | |
| Glass stem bubbler | Various | To infuse carbogen into aCSF | |
| Curved-tip forceps | World Precision Instruments | 501008 | To remove embryo head from egg |
| Two fine-tip forceps | World Precision Instruments | 501985 | For micro-dissection |
| 50 ml Beaker | various | ||
| Rhodamine Dextran Amine (RDA) | Invitrogen | various | Fluorescent axon tracer |
| Triton X-100 | ICN Biomedicals | ||
| Phosphate Buffered Saline, (1X PBS) | Various | Standard lab reagent | |
| Thin Wall Glass Capillaries, 1.2 OD, .9 ID 4″ (100 mm) length | World Precision Instruments | TW120F-4 | Load with RDA. Each capillary makes two glass micropipettes |
| Needle / Pipette puller | David Kopf Instruments | Model 720 | Settings used: Heat 16.4, Solenoid 2.2 |
| Picospritzer | Parker Instrumentation | various | Attach by fine tubing to glass micropipette |
| Micromanipulator | Narishige | various | |
| Dissection microscope with fluorescence | Various | ||
| 4% Paraformaldehyde | Various | Standard lab reagent | |
| anti-Neurofilament antibody, optional | Millipore | AB1991 | Follow histological protocol recommended by manufacturer |
| Cryostat and associated materials for sectioning | Leica | various | |
| Epifluorescent microscope for imaging | Zeiss, various |
References
- Groves, A. K., Fekete, D. M. Shaping sound in space: the regulation of inner ear patterning. Development. 139, 245-257 (2012).
- Pflieger, J. F., Cabana, T. The vestibular primary afferents and the vestibulospinal projections in the developing and adult opossum, Monodelphis domestica. Anatomy and Embryology. 194, 75-88 (1996).
- Molea, D., Rubel, E. W. Timing and topography of nucleus magnocellularis innervation by the cochlear ganglion. The Journal of Comparative Neurology. 466, 577-591 (2003).
- Bissonnette, J. P., Fekete, D. M. Standard atlas of the gross anatomy of the developing inner ear of the chicken. The Journal of Comparative Neurology. 368, 620-630 (1996).
- Brigande, J. V., Kiernan, A. E., Gao, X., Iten, L. E., Fekete, D. M. Molecular genetics of pattern formation in the inner ear: do compartment boundaries play a role. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97, 11700-11706 (1073).
- Bellairs, R., Osmond, M. . The atlas of chick development. , (2005).
- Manley, G. A., Haeseler, C., Brix, J. Innervation patterns and spontaneous activity of afferent fibres to the lagenar macula and apical basilar papilla of the chick’s cochlea. Hearing Research. 56, 211-226 (1991).
- Code, R. A. Efferent neurons to the macular lagena in the embryonic chick. Hearing Research. 82, 26-30 (1995).
- Maklad, A., Fritzsch, B. Development of vestibular afferent projections into the hindbrain and their central targets. Brain Research Bulletin. 60, 497-510 (2003).
- Rubel, E. W., Fritzsch, B. Auditory system development: primary auditory neurons and their targets. Annual Review of Neuroscience. 25, 51-101 (2002).
- Satoh, T., Fekete, D. M. Lineage analysis of inner ear cells using genomic tags for clonal identification. Methods Mol. Biol. 493, 47-63 (2009).
- Bok, J., Chang, W., Wu, D. K. Patterning and morphogenesis of the vertebrate inner ear. The International Journal of Developmental Biology. 51, 521-533 (2007).
- Appler, J. M., Goodrich, L. V. Connecting the ear to the brain: Molecular mechanisms of auditory circuit assembly. Progress in Neurobiology. 93, 488-508 (2011).
- Bulankina, A. V., Moser, T. Neural circuit development in the mammalian cochlea. Physiology (Bethesda). 27, 100-112 (2012).
- Fekete, D. M., Campero, A. M. Axon guidance in the inner ear. The International Journal of Developmental Biology. 51, 549-556 (2007).
- Momose-Sato, Y., Glover, J. C., Sato, K. Development of functional synaptic connections in the auditory system visualized with optical recording: afferent-evoked activity is present from early stages. Journal of Neurophysiology. 96, 1949-1962 (2006).
- Marrs, G. S., Spirou, G. A. Embryonic assembly of auditory circuits: spiral ganglion and brainstem. The Journal of Physiology. 590, 2391-2408 (2012).
- Milo, M., et al. Genomic analysis of the function of the transcription factor gata3 during development of the mammalian inner ear. PloS One. 4, e7144 (2009).
- Fritzsch, B., Eberl, D. F., Beisel, K. W. The role of bHLH genes in ear development and evolution: revisiting a 10-year-old hypothesis. Cellular and Molecular Life Sciences : CMLS. 67, 3089-3099 (2010).
- Jahan, I., Kersigo, J., Pan, N., Fritzsch, B. Neurod1 regulates survival and formation of connections in mouse ear and brain. Cell and Tissue Research. 341, 95-110 (2010).
- Huang, E. J., et al. Brn3a is a transcriptional regulator of soma size, target field innervation and axon pathfinding of inner ear sensory neurons. Development. 128, 2421-2432 (2001).
- Jones, J. M., Warchol, M. E. Expression of the Gata3 transcription factor in the acoustic ganglion of the developing avian inner ear. The Journal of Comparative Neurology. 516, 507-518 (2009).
- Lu, C. C., Appler, J. M., Houseman, E. A., Goodrich, L. V. Developmental profiling of spiral ganglion neurons reveals insights into auditory circuit assembly. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 31, 10903-10918 (2011).
