Summary

Demir Kaynağı Olarak İnsan Hemoglobin kullanarak Staphylococcus aureus Büyüme

Published: February 07, 2013
doi:

Summary

Burada bir büyüme tahlil tarif<em> Staphylococcus aureus</em> Mevcut besin demir tek kaynak olarak hemoglobin kullanarak. Bu testte elde edilen hemoglobin demir elde etme ile ilgili bakteri faktörlerin rolü kurar.

Abstract

S. aureus hayati metabolik fonksiyonları ve hastalık yapan yürütmek için demir gerektiren bir patojen bakteridir. Insan konak içindeki demirin en bol rezervuar hemoglobin kofaktörüdür heme vardır. Hemoglobin demir elde etmek için, S. aureus demir-regüle yüzey belirleyicisi (Isd) sistemi 1 olarak bilinen karmaşık bir sistem kullanır. Isd sistem ilk bind konak hemoglobin Bileşenleri, daha sonra ayıklamak ve heme ithalat ve nihayet bakteriyel sitoplazma 2,3 heme demir kurtarmak. Bu yol vitro çalışmalar 4-9 sayısız aracılığıyla diseke edilmiştir. Ayrıca, enfeksiyon için Isd sistemin katkısı art arda 8,10-14 fare modellerinde ortaya konmuştur. Hemoglobin kaynaklı demir edinimi Isd sistemin katkısı kurulması ve büyüme daha zorlu olduğu kanıtlanmıştır. Bir tek demir kaynağı olarak hemoglobin kullanarak Büyüme deneyleri b karmaşıktıry büyüme ortamında serbest demir kirletici ticari olarak temin hemoglobin kararsızlık, ve demir şelatlar ile ilişkili toksisite. İşte biz bu sınırlamalarının üstesinden bir yöntem sunuyoruz. Yüksek kaliteli hemoglobin taze kandan hazırlanmıştır ve sıvı azot içinde saklanır. Arıtılmış hemoglobin içine ilave edilir, orta omurgalı konukçu içerisindeki patojenlerin karşılaştığı demir-fakir ortamda taklit demir tüketmek. S. açlıktan tarafından serbest demir aureus ve biz, hemoglobin bağlamak heme ayıklamak, bakteri hücre zarfı ile heme geçmek ve sitoplazmada heme aşağılamak yeteneğini tamamen bağımlı bir şekilde büyümesine neden hemoglobin minimal manipüle formu ile ilave. Bu tahlil S. hemoglobin-/heme-derived demir iktisap mekanizmaları aydınlatmak isteyen araştırmacılar için yararlı olacaktır aureus ve muhtemelen diğer bakteriyel patojenler.

Protocol

1. Taze Kan gelen Hemoglobin saflaştırılması Bir antikoagülan ile desteklenmiş taze insan kanı edinin. Saflaştırma boyunca buz üzerinde veya 4 de kan ° C tutun. 1,500 x g'de 20 dakika boyunca kan santrifüjleyin. Kırmızı kan hücrelerinin (eritrositler), tüpün altında olacaktır. Dikkatlice süpernatan aspire ve yavaşça buz gibi soğuk% 0.9 (ağırlık / hacim) NaCl solüsyonu içinde pelet tekrar süspansiyon. Santrifüj tekrarlayın ve 3 kez yıkayın. Buz gibi so?…

Representative Results

Biz HPLC (Protokol adım 1.7) ile hemolizat insan hemoglobin Temizlendikleri. Şekil 1 gösterir 280 ve 410 nm dalga boylarında eluat absorbans kaydedildi. Fraksiyon 5 toplandı ve diğer fraksiyonlar atıldı. Eluat mililitrede hemoglobin beş ile on beş miligram Verimleri genellikle elde edilir. Saflaştırılmış hemoglobin kopya halinde SDS-PAGE ile analiz edildi ve jeller ya da proteinler için boyandı ya da nitroselüloz üzerine transfer edildi ve (Protokol adım 1.10, Şekil 2)</stro…

Discussion

Demir yaşamın 15 tüm krallıklardan organizmalar tarafından gerekli olan temel bir besindir. Omurgalılar, demir bu öğe tarafından kaynaklanan zehirlenme önlemek için tecrit edilir. Bu haciz de beslenme bağışıklık 16 olarak bilinen bir süreçte mikroplar istila demir gizler. Buna karşılık, patojenler beslenme bağışıklık engelleyecek stratejiler geliştirmişlerdir. Böyle bir mekanizma hemoglobin dayanır, hangi ana 17 içindeki demirin en bol kaynağıdır. Hemogl…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Bu araştırma, Alerji ve Bulaşıcı Hastalıklar Ulusal Enstitüsü ABD Kamu Sağlığı Servisi hibe AI69233 ve AI073843 tarafından desteklenmiştir. EPS Bulaşıcı Hastalıklar Patogenez bir Burroughs Wellcome Üyesidir. KPH Hücresel ve Moleküler Mikrobiyoloji Eğitimi Hibe Programı 5 T32 A107611-10 tarafından finanse edildi.

Materials

Name of Reagent/Material Company Catalogue Number Comments
HPLC anion exchange column Varian PL1551-3802
Drabkin’s reagent Sigma D5941-6VL
Hemoglobin standard Pointe Scientific H7506-STD
RPMI HyClone SH30011.02
Chelex 100 sodium form Sigma C7901
EDDHA LGC Standards GmbH ANC 001
Hemoglobin a antibody Santa Cruz Biotechnology, Inc SC-21005
Tryptic soy agar BD 236920

References

  1. Mazmanian, S., et al. Passage of heme-iron across the envelope of Staphylococcus aureus. Science. 299, 906-909 (2003).
  2. Pishchany, G., Skaar, E. P. Taste for blood: hemoglobin as a nutrient source for pathogens. PLOS Pathogens. 8, e1002535 (2012).
  3. Haley, K. P., Skaar, E. P. A battle for iron: host sequestration and Staphylococcus aureus acquisition. Microbes and infection. Institut Pasteur. 14, 217-227 (2012).
  4. Krishna Kumar, K., et al. Structural basis for hemoglobin capture by Staphylococcus aureus cell-surface protein. IsdH. The Journal of biological chemistry. 286, 38439-38447 (2011).
  5. Grigg, J. C., Mao, C. X., Murphy, M. E. Iron-coordinating tyrosine is a key determinant of NEAT domain heme transfer. Journal of Molecular Biology. 413, 684-698 (2011).
  6. Villareal, V. A., et al. Transient weak protein-protein complexes transfer heme across the cell wall of Staphylococcus aureus. Journal of the American Chemical Society. 133, 14176-14179 (2011).
  7. Muryoi, N., et al. Demonstration of the iron-regulated surface determinant (Isd) heme transfer pathway in Staphylococcus aureus. J. Biol. Chem. 283, 28125-28136 (2008).
  8. Reniere, M. L., Skaar, E. P. Staphylococcus aureus haem oxygenases are differentially regulated by iron and haem. Mol. Microbiol. 69, 1304-1315 (2008).
  9. Liu, M., et al. Direct hemin transfer from IsdA to IsdC in the iron-regulated surface determinant (Isd) heme acquisition system of Staphylococcus aureus. J. Biol. Chem. 283, 6668-6676 (2008).
  10. Pishchany, G., et al. Specificity for human hemoglobin enhances Staphylococcus aureus infection. Cell Host Microbe. 8, 544-550 (2010).
  11. Pishchany, G., Dickey, S. E., Skaar, E. P. Subcellular localization of the Staphylococcus aureus heme iron transport components IsdA and IsdB. Infect. Immun. 77, 2624-2634 (2009).
  12. Torres, V. J., Pishchany, G., Humayun, M., Schneewind, O., Skaar, E. P. Staphylococcus aureus IsdB is a hemoglobin receptor required for heme iron utilization. J. Bacteriol. 188, 8421-8429 (2006).
  13. Kim, H. K., et al. IsdA and IsdB antibodies protect mice against Staphylococcus aureus abscess formation and lethal challenge. Vaccine. 28, 6382-6392 (2010).
  14. Cheng, A. G., et al. Genetic requirements for Staphylococcus aureus abscess formation and persistence in host tissues. Faseb J. 23, 3393-3404 (2009).
  15. Andreini, C., Bertini, I., Cavallaro, G., Holliday, G. L., Thornton, J. M. Metal ions in biological catalysis: from enzyme databases to general principles. J. Biol. Inorg. Chem. 13, 1205-1218 (2008).
  16. Weinberg, E. D. Iron availability and infection. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – General Subjects. 1790, 600-605 (2009).
  17. Drabkin, D. Metabolism of the Hemin Chromoproteins. Physiological Reviews. 31, 345-431 (1951).
  18. Graversen, J. H., Madsen, M., Moestrup, S. K. CD163: a signal receptor scavenging haptoglobin-hemoglobin complexes from plasma. The international journal of biochemistry & cell biology. 34, 309-314 (2002).
  19. Torres, V. J., et al. Staphylococcus aureus Fur regulates the expression of virulence factors that contribute to the pathogenesis of pneumonia. Infect. Immun. 78, 1618-1628 (2010).
  20. Hammer, N. D., Skaar, E. P. Molecular Mechanisms of Staphylococcus aureus Iron Acquisition. Annu. Rev. Microbiol. , (2011).
  21. Hurd, A. F., et al. The iron-regulated surface proteins IsdA, IsdB, and IsdH are not required for heme iron utilization in Staphylococcus aureus. Fems. Microbiology Letters. 329, 93-100 (2012).
  22. Boys, B. L., Kuprowski, M. C., Konermann, L. Symmetric behavior of hemoglobin alpha- and beta- subunits during acid-induced denaturation observed by electrospray mass spectrometry. Biochemistry. 46, 10675-10684 (2007).
  23. Williams, R. C., Tsay, K. Y. A convenient chromatographic method for the preparation of human hemoglobin. Analytical Biochemistry. 54, 137-145 (1973).
  24. Shen, T. J., et al. Production of unmodified human adult hemoglobin in Escherichia coli. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90, 8108-8112 (1993).
  25. Manjula, B. N., Acharya, S. A. Purification and molecular analysis of hemoglobin by high-performance liquid chromatography. Methods Mol. Med. 82, 31-47 (2003).
  26. Neilands, J. B. Microbial envelope proteins related to iron. Annual review of microbiology. 36, 285-309 (1982).
  27. Chart, H., Buck, M., Stevenson, P., Griffiths, E. Iron regulated outer membrane proteins of Escherichia coli: variations in expression due to the chelator used to restrict the availability of iron. Journal of General Microbiology. 132, 1373-1378 (1986).
  28. Rogers, H. J. Iron-Binding Catechols and Virulence in Escherichia coli. Infection and Immunity. 7, 445-456 (1973).

Play Video

Cite This Article
Pishchany, G., Haley, K. P., Skaar, E. P. Staphylococcus aureus Growth using Human Hemoglobin as an Iron Source. J. Vis. Exp. (72), e50072, doi:10.3791/50072 (2013).

View Video