Mesures systolique ventriculaire droite pression en combinaison avec la récolte du poumon et des échantillons de tissus immunitaires chez des souris
Summary
Un protocole spécifique et rapide à la fois étudier la fonction cardiaque droite, une inflammation des poumons, et la réponse immunitaire est décrit comme un outil d'apprentissage. Vidéo et chiffres décrivent la physiologie et de techniques de microdissection dans une équipe organisée approche qui est adaptable pour être utilisé pour les petites et grandes études taille.
Abstract
La fonction du cœur droit est de pomper le sang à travers les poumons, reliant ainsi la physiologie du cœur droit et la physiologie vasculaire pulmonaire. L'inflammation est un modificateur de la commune fonctions cardiaques et pulmonaires, par l'élaboration d'une infiltration cellulaire, la production de cytokines et de facteurs de croissance, et en lançant des processus de remodelage 1.
Par rapport au niveau du ventricule gauche, le ventricule droit est une pompe à basse pression qui fonctionne dans une zone relativement étroite de variations de pression. L'augmentation des pressions artérielles pulmonaires sont associés à une pression accrue dans le lit vasculaire pulmonaire et l'hypertension pulmonaire 2. L'hypertension artérielle pulmonaire est souvent associée à des maladies pulmonaires inflammatoires, par exemple maladie pulmonaire obstructive chronique, maladies auto-immunes ou 3. Parce que l'hypertension artérielle pulmonaire confère un mauvais pronostic pour la qualité de vie et l'espérance de vie, beaucoup de recherches sont orientées vers la compréhension des mécanismes qui might être la cible de 4 intervention pharmaceutique. Le principal défi pour le développement d'outils de gestion efficaces pour l'hypertension pulmonaire reste la complexité de la compréhension simultanée des changements moléculaires et cellulaires dans le cœur droit, les poumons et le système immunitaire.
Ici, nous présentons un workflow procédural pour la mesure rapide et précise des variations de pression dans le cœur droit de la souris et la récolte simultanée des échantillons de cœur, les poumons et les tissus immunitaires. La méthode est basée sur le cathétérisme directe du ventricule droit par la veine jugulaire en gros torse souris, d'abord développé dans les années 1990 comme mesure de substitution de pressions dans l'artère pulmonaire 5-13. L'équipe a organisé approche facilite une technique très rapide cathétérisme cardiaque droit. Cela permet d'effectuer les mesures sur des souris qui respirent spontanément l'air ambiant. L'organisation du flux de travail dans les différents domaines de travail-réduit le délai du temps et ouvre la possibilité d'effectuer simultanément des expériences de physiologie et de la récolte des tissus immunitaire, cardiaques et pulmonaires.
Le workflow procédural décrit ici peut être adapté à une grande variété de paramètres de laboratoire et des plans d'étude, des petits, des expériences ciblées, aux grands tests de dépistage de drogue. L'acquisition simultanée de données physiologie cardiaque qui peut être élargi pour inclure l'échocardiographie 5,14-17 et la récolte des tissus cardiaques, pulmonaires et du système immunitaire réduit le nombre d'animaux nécessaires pour obtenir des données qui déplacent la base des connaissances scientifiques vers l'avant. Le workflow procédural présentée ici fournit également une base idéale pour acquérir des connaissances sur les réseaux qui relient immunitaire, pulmonaire et la fonction cardiaque. Les mêmes principes décrits ici peuvent être adaptées pour étudier d'autres organes ou supplémentaires, au besoin.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le flux expérimentale décrite ici permet une mesure rapide et simultanée de la pression systolique ventriculaire droite et la récolte d'échantillons pour l'analyse des réponses dans les poumons, le cœur et le système immunitaire chez la souris. La procédure combine des mesures de la physiologie cardiaque, micro-dissection des tissus et la récolte ultérieure pour les études de cellules vivantes, l'analyse histologique ou omiques-analyse des tissus. La procédure complète prend moins de 20 minutes…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été financé par le National Institutes of Health 1R21HL092370-01 (GG), 1R01 HL095764-01 (GG); R01HL082694 (JW); American Heart Association, affiliée Fondateurs (0855943D, GG); Stony Wold – Herbert Fonds, New York (SHP).
Materials
| Name | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Reagents | |||
| 2-Methyl-2-butanol | Sigma-Aldrich | 152463 | |
| 2,2,2-Tribromoethanol | Sigma-Aldrich | T48402 | |
| disinfectant soap (Coverage Spray TB plus Steris) | Fisher Scientific | 1629-08 | |
| Ethyl Alcohol, 200 Proof, Absolute, Anhydrous ACS/USP Grade | PHARMCO-AAPER | 111000200 | Dilute to 70 % with distilled water |
| Formaldehyde solution | Sigma-Aldrich | F1635-500ML | Dilute to a 7-10 % formaldehyde concentration at a PBS concentration of 1x using PBS stock solution and water |
| Hanks solution, no calcium, magnesium | Fisher Scientific | 21-022-CV | |
| O.C.T | Tissue-Tek | 4583 | |
| Penicillin (10,000 U/ml) / Streptomycin (10,000 mg/ml) solution | Thermo Scientific | SV30010 | |
| Phosphate buffered saline (PBS), no calcium, no magnesium, 1x and 10x solutions | Fisher Scientific | ||
| Sodium pentobarbital 26% | Fort Dodge Animal Health | NDC 0856-0471-01 | |
| Labware | |||
| Plates 12, 24, 96 well | Falcon | ||
| Transfer Pipet | Fisher Scientific | 13-711-9BM | |
| Tube, EDTA coated | Sarstedt | 2013-08 | |
| Tubes 0.65 ml and 1.7 ml micro-centrifuge | VWR | ||
| Tubes 12 x 75 mm polypropylene | Fisher Scientific | 14-956-1D | |
| Tubes, various sizes, polypropylene | Fisher Scientific | ||
| Instruments | |||
| Forceps, Dumon #5 Fine | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| Forceps, extra fine graefe -0.5 mm tips curved | Fine Science Tools | 11152-10 | |
| Forceps, extra fine graefe -0.5 mm tips straight | Fine Science Tools | 11150-10 | |
| Cannula 18 ga, 19 ga | BD | Precision Glide Needles | Cut to optimal length, blunted and outside rasped to create a rough outside surface. |
| Scissors, Dissector scissors-slim blades 9 cm | Fine Science Tools | 14081-09 | |
| Suture for BAL, braided silk suture, 4-0 | Fine Science Tools | SP116 | |
| Suture for right heart catheterization, braided silk suture, 6-0 | Teleflex medical | 18020-60 | |
| Syringe, 1 ml | BD | 309659 | |
| Equipment | |||
| Amplifier, PowerLab 4/30 | ADInstrument | Model ML866 | |
| Catheter, pressure F1.4 | Millar Instruments, Inc | 840-6719 | |
| Dissecting Microscope | Variscope | ||
| Forceps, Vannas spring scissors-2 mm blades | Fine Science Tools | 15000-00 | |
| Halogen Illuminated Desk Magnifier | Fisher Scientific | 11-990-56 | |
| Laptop computer | Asus | Model number A52F i5 processor; 15 inch | |
| Light Source | Amscope | HL-250-A | |
| Pressure Control Unit | Millar Instruments, Inc | PCU-2000 | |
| Software, Labchart-Pro V.7 | AD Instruments |
References
- Price, L. C., et al. Inflammation in pulmonary arterial hypertension. Chest. 141, 210-221 (2012).
- Olschewski, H., et al. Cellular pathophysiology and therapy of pulmonary hypertension. J. Lab. Clin. Med. 138, 367-377 (2001).
- Hassoun, P. M., et al. Inflammation, growth factors, and pulmonary vascular remodeling. J. Am. Coll. Cardiol. 54, S10-S19 (2009).
- Rabinovitch, M. Molecular pathogenesis of pulmonary arterial hypertension. J. Clin. Invest. 118, 2372-2379 (2008).
- Steudel, W., et al. Sustained pulmonary hypertension and right ventricular hypertrophy after chronic hypoxia in mice with congenital deficiency of nitric oxide synthase 3. J. Clin. Invest. 101, 2468-2477 (1998).
- Zaidi, S. H., You, X. M., Ciura, S., Husain, M., Rabinovitch, M. Overexpression of the serine elastase inhibitor elafin protects transgenic mice from hypoxic pulmonary hypertension. Circulation. 105, 516-521 (2002).
- Guignabert, C., et al. Tie2-mediated loss of peroxisome proliferator-activated receptor-gamma in mice causes PDGF receptor-beta-dependent pulmonary arterial muscularization. Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 297, L1082-L1090 (2009).
- West, J., et al. Pulmonary hypertension in transgenic mice expressing a dominant-negative BMPRII gene in smooth muscle. Circ. Res. 94, 1109-1114 (2004).
- Cook, S., et al. Increased eNO and pulmonary iNOS expression in eNOS null mice. Eur. Respir. J. 21, 770-773 (2003).
- West, J., et al. Mice expressing BMPR2R899X transgene in smooth muscle develop pulmonary vascular lesions. Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 295, L744-L755 (2008).
- Tu, L., et al. Autocrine fibroblast growth factor-2 signaling contributes to altered endothelial phenotype in pulmonary hypertension. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 45, 311-322 (2011).
- Daley, E., et al. Pulmonary arterial remodeling induced by a Th2 immune response. J. Exp. Med. 205, 361-372 (2008).
- Song, Y., et al. Inflammation, endothelial injury, and persistent pulmonary hypertension in heterozygous BMPR2-mutant mice. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 295, 677-690 (2008).
- Thibault, H. B., et al. Noninvasive assessment of murine pulmonary arterial pressure: validation and application to models of pulmonary hypertension. Circulation. Cardiovascular imaging. 3, 157-163 (2010).
- Otto, C., et al. Pulmonary hypertension and right heart failure in pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide type I receptor-deficient mice. Circulation. 110, 3245-3251 (2004).
- Burton, V. J., et al. Attenuation of leukocyte recruitment via CXCR1/2 inhibition stops the progression of PAH in mice with genetic ablation of endothelial BMPR-II. Blood. 118, 4750-4758 (2011).
- Fujita, M., et al. Pulmonary hypertension in TNF-alpha-overexpressing mice is associated with decreased VEGF gene expression. J. Appl. Physiol. 93, 2162-2170 (2002).
- Motley, H. L., Cournand, A., Werko, L., Himmelstein, A., Dresdale, D. The Influence of Short Periods of Induced Acute Anoxia Upon Pulmonary Artery Pressures in Man. Am. J. Physiol. 150, 315-320 (1947).
- Liljestrand, G. Regulation of Pulmonary Arterial Blood Pressure. Arch. Intern. Med. 81, 162-172 (1948).
- Euler, U. S. V., Liljestrand, G. Observations on the pulmonary arterial blood pressure in the cat. Acta Physiol. Scand. 12, 301-320 (1946).
- Van den Broeck, W., Derore, A., Simoens, P. Anatomy and nomenclature of murine lymph nodes: Descriptive study and nomenclatory standardization in BALB/cAnNCrl mice. Journal of immunological. 312, 12-19 (2006).
- Rabinovitch, M., et al. Angiotensin II prevents hypoxic pulmonary hypertension and vascular changes in rat. Am. J. Physiol. 254, 500-508 (1988).
- Rabinovitch, M., Gamble, W., Nadas, A. S., Miettinen, O. S., Reid, L. Rat pulmonary circulation after chronic hypoxia: hemodynamic and structural features. Am. J. Physiol. 236, 818-827 (1979).
- Rabinovitch, M., et al. Changes in pulmonary blood flow affect vascular response to chronic hypoxia in rats. Circ. Res. 52, 432-441 (1983).
- Kugathasan, L., et al. The angiopietin-1-Tie2 pathway prevents rather than promotes pulmonary arterial hypertension in transgenic mice. J. Exp. Med. 206, 2221-2234 (2009).
- Bearer, C., Emerson, R. K., ORiordan, M. A., Roitman, E., Shackleton, C. Maternal tobacco smoke exposure and persistent pulmonary hypertension of the newborn. Environ. Health Persp. , 105-202 (1997).
- Graham, B. B., et al. Schistosomiasis-induced experimental pulmonary hypertension: role of interleukin-13 signaling. Am. J. Pathol. 177, 1549-1561 (2010).
- Butrous, G., Ghofrani, H. A., Grimminger, F. Pulmonary vascular disease in the developing world. Circulation. 118, 1758-1766 (2008).
- Crosby, A., et al. Praziquantel reverses pulmonary hypertension and vascular remodeling in murine schistosomiasis. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 184, 467-473 (2011).
