Uma melhor compreensão dos mecanismos que regem o tráfico receptor entre a membrana do plasma (PM) e compartimentos intracelulares requer uma abordagem experimental, com excelentes resoluções espaciais e temporais. Além disso, esta abordagem também deve ter a capacidade de distinguir os receptores localizados na PM daqueles em compartimentos intracelulares. Mais importante ainda, a detecção de receptores de uma vesícula única requer excelente sensibilidade de detecção, uma vez que cada vesícula leva apenas um pequeno número de receptores. Abordagens normalizadas para examinar o tráfico receptor incluem a biotinilação da superfície seguido de detecção bioquímica, que carece tanto as resoluções necessárias espaciais e temporais, e exame de microscopia de fluorescência de receptores de superfície, o que requer immunolabeled fixação química de células e, portanto, carece de resolução temporal suficiente ^1-6. Para superar essas limitações, nós e outros têm desenvolvido e utilizado um novo stratégia que permite a visualização da inserção dinâmica de receptores para a PM, com excelentes resoluções espaciais e temporais ^7-17. A abordagem inclui a marcação de uma GFP sensível ao pH, o pHluorin superecliptic ^18, para o domínio N-terminal extracelular de receptores. Superecliptic pHluorin tem a propriedade única de ser fluorescente a pH neutro e não fluorescente a pH ácido (pH <6,0). Portanto, os receptores marcados são não-fluorescente quando dentro do lúmen ácida tráfico de vesículas intracelulares ou compartimentos endossomais e tornam-se facilmente visualizado apenas quando exposto ao ambiente extracelular pH neutro, na superfície exterior do PM. Nossa estratégia, consequentemente, permite-nos distinguir receptores de superfície PM daqueles dentro de vesículas tráfico intracelular. Suficientes para alcançar resoluções espaciais e temporais, bem como a sensibilidade necessária para estudar o tráfico dinâmica dos receptores, foram empregados interna total reflectemion microscopia fluorescente (TIRFM), o que nos permitiu obter a melhor resolução espacial da imagem óptica (~ 170 nm), a resolução temporal do vídeo de taxa de microscopia (30 quadros / seg), e a sensibilidade para a detecção de fluorescência de uma única GFP molécula. Pela imagem pHluorin-marcado receptores sob TIRFM, fomos capazes de visualizar diretamente eventos receptores individuais inserção na PM em neurônios cultivados. Esta abordagem de imagem pode, potencialmente, ser aplicada a qualquer proteína de membrana com um domínio extracelular que poderiam ser marcadas com pHluorin superecliptic, e permitirá a dissecação dos mecanismos chave de pormenor que regem a inserção de proteínas de membrana diferentes (receptores, canais de iões, transportadores, etc) para da PM.