Durchführen Vaginal Lavage, Kristallviolettfärbung und Vaginal zytologische Beurteilung für Maus Zyklusstand Staging Identification
Summary
Hier beschreiben wir, wie auf der Bühne des murinen reproduktiven (Proöstrus Brunst, Metöstrus oder Diöstrus) durch einfache, nicht-invasive Erfassung und zytologische Beurteilung der vaginalen Abstrich Proben zu identifizieren. Wir beschreiben weiterhin, wie Vaginalzytologie zirkulierenden Hormonspiegel zugrunde liegenden Übergang durch die murine reproduktiven Zyklus widerspiegelt.
Abstract
Ein schnelles Mittel zur Bewertung Reproduktionsstatus bei Nagern dient nicht nur bei der Untersuchung von reproduktiven Funktionsstörungen, sondern auch für die Herstellung von neuen Mausmodellen von Krankheiten und Untersuchungen über die hormonelle Regulation der Gewebedegeneration (oder Regeneration) nach pathologischen Herausforderung erforderlich. Proöstrus Brunst, Metöstrus und Diöstrus: Der murine reproduktiven (oder Östrus-Zyklus) ist in 4 Stufen aufgeteilt. Definierte Schwankungen der zirkulierenden Spiegel der ovariellen Steroide 17-β-Östradiol und Progesteron, luteinisierendes die Gonadotropine und Follikel-stimulierende Hormone, und die luteotropic Hormons Prolaktin Signalwechsel durch diese reproduktiven Stadien. Änderungen in der Zelle Typologie im murinen Vaginalkanals spiegeln diese zugrunde liegenden endokrinen Veranstaltungen. Täglich Beurteilung des relativen Verhältnisses der kernhaltige Epithelzellen, verhornten Plattenepithelzellen und Leukozyten in Vaginalabstrichen kann zum murinen Östrus identifizierenStufen. Der Grad der Invasivität jedoch beim Sammeln diese Proben können Reproduktionsstatus verändern und eine entzündliche Reaktion hervorzurufen, die zytologische Beurteilung der Abstriche verwirren können eingesetzt. Hier beschreiben wir eine einfache, nicht-invasive Protokoll, das verwendet, um die Phase des Östrus Zyklus von einer weiblichen Maus ohne Änderung ihrer reproduktiven Zyklus zu bestimmen. Wir beschreiben, wie zwischen den vier Stufen des Östrus Zyklus durch Sammlung und Analyse der vorherrschenden Zelle Typologie Vaginalabstrichen und wir zeigen, wie diese Änderungen gegenüber endokrinen Status interpretiert werden können differenzieren.
Protocol
Discussion
Diese Veränderungen in der Zelle Typologie sind indikativ der zugrunde liegenden endokrinen Veranstaltungen. Die Phase des Proöstrus Östrocyclus entspricht der menschlichen follikulären Phase des Menstruationszyklus 5 und wird durch einen präovulatorischen Erhöhung des zirkulierenden 17-β-Estradiol Ebenen 6, sowie einem kleinen Anstieg der Prolaktin 7 (Abbildung 2 definiert, Proöstrus, links). Die Zunahme der 17-β-Estradiol stimuliert indirekt Gonadotropin-Releasing-Hormon-Neuronen im Hypothalamus und Septum, das wiederum aktivieren reagierenden Zellen im Hypophysenvorderlappen zu Luteinisierungshormon und Follikel-stimulierendes Hormon in den Kreislauf 8,9 freisetzen (Abbildung 2 , Proöstrus, links). In Vaginalabstrichen von Tieren in Proöstrus genommen, sind die Zellen fast ausschließlich oval kernhaltige Epithelzellen (1D, Bild 2, Proöstrus, rechts). Der Peak im Follikel-stimulierendes HORMein Ebenen-Signale Eisprung und Eintrag in die Brunst 10,11. Während Brunst, 17-β-Östradiol Niedergang und Prolaktinspiegel peak 6,7 (Abbildung 2, Estrus, links). Vaginalabstrichen werden von fast ausschließliche Detektion von unregelmäßig geformten verhornten Plattenepithel Zellen oft in Klumpen (1E, Bild 2, Estrus, rechts) gekennzeichnet. Einstieg in Metöstrus fällt mit einem kontinuierlichen Anstieg der Progesteron Hormonspiegel 6 und entspricht dem Beginn der menschlichen Lutealphase 12 (Abbildung 2, Metöstrus, links). Da Progesteron beginnen zu steigen, und es gibt eine kleine Zunahme der 17-β-Estradiol in Reaktion auf Gelbkörper Aktivierung 6,13,14 (Abbildung 2, Metöstrus, links). Die Zelltypen in Vaginalabstrichen während dieser Phase sind fragmentiert, verhornten Epithelzellen und kleinere dunklere Flecken Leukozyten (Figure 1F, Bild 2, Metöstrus, rechts). Schließlich tritt Eintritt in Diöstrus in Mäusen und Zirkulieren Progesteronspiegel Peak 6, entsprechend dem menschlichen späten Lutealphase 12. Regression des Corpus luteum führt zu einer weiteren starken Rückgang der Progesteron-Spiegel 15,16 (Abbildung 2, Diöstrus, links). Leukozyten überwiegen in Abstrichen beim Diöstrus. Die Häufigkeit von verhornten Epithelzellen verringert und kernhaltige Epithelzellen beginnen, unmittelbar vor dem Übergang zu Proöstrus (Figur 1G, Bild 2, Diöstrus, rechtes Feld) detektiert werden.
Zusammenfassend kann diese einfachen, routinemäßigen Protokoll zur täglichen hormonelle Schwankungen schätzen und zu etablieren Östrus Bühne in Versuchsmäusen ohne Änderung reproduktiven Status, wenn die folgenden Vorsichtsmaßnahmen beachtet werden. Die Probenahme sollte nicht mehr als einmal täglich mit dem nicht-invasiven Protokoll desc durchgeführt werdenhier wiederholt das Eindringen des Vaginalkanals, Aspiration, und Agitation gegenüber ribed. Dies kann dazu führen, vaginale Reizung was zu einer entzündlichen Reaktion resultierende 17 in Leukozyten und anderen Zelltypen vorhanden sein, die in Abstrichen zytologische Beurteilung verwirren kann. Außerdem, selbst in Kolonie untergebracht Weibchen, ist es normal, erweiterte Diöstrus und Östrus Stufen in verschiedenen Mäusen sowie Induktion von Anöstrus 18 und diese Identifikation ist nützlich bei der Interpretation der hormonelle Auswirkungen im Bereich der reproduktiven, Geschlecht und Krankheit Studien zu sehen. Variabilität in der Zykluslänge wird auch mit dem Alter und vom Gehäuse Unterschiede innerhalb Kolonien (Einzelperson oder Gruppe-Gehäuse) der Frauen 7,19-21 eingeführt. Frauen in nur weibliche Kolonien untergebracht aufhören kann Radfahren und in einen Zustand der längeren Diöstrus 18,22,23 obwohl Radfahren kann durch die Einwirkung von Käfigen vorbehandelt mit männlichen Urin zum Radfahren 24,25 entlocken wieder eingesetzt werden. Somit festzustellen individual Zykluslängen für eine bestimmte Maus, ist es empfehlenswert, dass die nicht-invasive Beurteilung hier beschriebenen täglich durchgeführt werden, mit Sorgfalt, bis zwei komplette Zyklen beobachtet werden.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir möchten Marc Leonard von der Carleton Immersive Media Studio danken für kompetente technische Unterstützung bei der Video-Produktion und-Bearbeitung und Dr. Martin Bertrand von der Carleton Immersive Media Studio / Neural Regeneration Labor für visuelle Modell Unterstützung. Die Autoren danken der Sachverständigengutachten von Dr. Marilyn Keaney und alle ihre engagierte Mitarbeiter an der University of Ottawa Animal Care und Veterinärwesen. Diese Arbeit wurde von der kanadischen Institute of Health Research (CIHR, MOP 62826) um SALB, der CIHR Institute of Aging and Strategic Training Initiative in Health Research / CIHR Training Program in Neurodegenerative Lipidomics (TGF 96.121) an SALB und SF, Canadian Foundation finanziert für Innovation zu SF, Ontario Innovation Trust SF und Autodesk Forschung zur SF. ACM erhält eine CIHR Banting und Best Promotion Award. NV erhält eine post-professionellen Stipendium Institute of Aging und CIHR Training Program in Neurodegenerative Lipidomics.
Materials
| Name | Company | Catalogue # |
| Sterile 200 μl pipette tips | Diamed | E340901 |
| Latex bulb (1 ml) | Fisher | 03-488-21 |
| Glass microscope slides | Fisher | 12-550-15 |
| Crystal Violet stain (25 g) | Fisher | C581-25 |
| Light-duty Tissue Wipers | VWR | 82003-820 |
| Glycerol | Fisher | BP229-1 |
| Microscope Cover Glass (22×30) | Fisher | 12-544A |
References
- Adler, N. T., Zoloth, S. R. Copulatory behavior can inhibit pregnancy in female rats. Science. 168, 1480-1482 (1970).
- Adler, N. T., Resko, J. A., Goy, R. W. The effect of copulatory behavior on hormonal change in the female rat prior to implantation. Physiology. 5, 1003-1007 (1970).
- Yang, J. J., Larsen, C. M., Grattan, D. R., Erskine, M. S. Mating-induced neuroendocrine responses during pseudopregnancy in the female mouse. Journal of. 21, 30-39 (2009).
- Hong, H. Changes in the mouse estrus cycle in response to BRCA1 inactivation suggest a potential link between risk factors for familial and sporadic ovarian cancer. Cancer research. 70, 221-228 (2010).
- Hawkins, S. M., Matzuk, M. M. The menstrual cycle: basic biology. Annals of the New York Academy of Sciences. 1135, 10-18 (2008).
- Walmer, D. K., Wrona, M. A., Hughes, C. L., Nelson, K. G. Lactoferrin expression in the mouse reproductive tract during the natural estrous cycle: correlation with circulating estradiol and progesterone. Endocrinology. 131, 1458-1466 (1992).
- Parkening, T. A., Collins, T. J., Smith, E. R. Plasma and pituitary concentrations of LH, FSH, and prolactin in aging C57BL/6 mice at various times of the estrous cycle. Neurobiology of aging. 3, 31-35 (1982).
- Sarkar, D. K., Chiappa, S. A., Fink, G., Sherwood, N. M. Gonadotropin-releasing hormone surge in pro-oestrous rats. Nature. 264, 461-463 (1976).
- Rajendren, G., Gibson, M. J. A confocal microscopic study of synaptic inputs to gonadotropin-releasing hormone cells in mouse brain: regional differences and enhancement by estrogen. Neuroendocrinology. 73, 84-90 (2001).
- Kumar, T. R., Wang, Y., Lu, N., Matzuk, M. M. Follicle stimulating hormone is required for ovarian follicle maturation but not male fertility. Nature. 15, 201-204 (1997).
- Montgomery, V., Loutradis, D., Tulchinsky, D., Kiessling, A. FSH-induced ovulation in intact and hypophysectomized mice. Journal of reproduction and fertility. 84, 1-6 (1988).
- Mihm, M., Gangooly, S., Muttukrishna, S. The normal menstrual cycle in women. Animal reproduction science. , 124-229 (2011).
- Appelgren, L. E. Histochemical demonstration of drug interference with progesterone synthesis. Journal of reproduction and. 19, 185-186 (1969).
- Sander, V. A., Facorro, G. B., Piehl, L., de Celis Rubin, E., Motta, A. B. Effect of DHEA and metformin on corpus luteum in mice. Reproduction. 138, 571-579 (2009).
- Stocco, C., Telleria, C., Gibori, G. The molecular control of corpus luteum formation, function, and regression. Endocrine reviews. 28, 117-149 (2007).
- Rudolph, M. Induction of overt menstruation in intact mice. PLoS One. 7, e32922 (2012).
- Yano, J., Lilly, E., Barousse, M., Fidel, P. L. Epithelial cell-derived S100 calcium-binding proteins as key mediators in the hallmark acute neutrophil response during Candida vaginitis. Infection and immunity. 78, 5126-5137 (2010).
- Whitten, W. K. Occurrence of anoestrus in mice caged in groups. The Journal of endocrinology. 18, 102-107 (1959).
- Lamond, D. R. Effect of stimulation derived from other animals of the same species on oestrous cycles in mice. The Journal of endocrinology. 18, 343-349 (1959).
- Nelson, J. F., Felicio, L. S., Randall, P. K., Sims, C. A longitudinal study of estrous cyclicity in aging C57BL/6J mice: I. Cycle frequency, length and vaginal cytology. Biology of reproduction. 27, 327-339 (1982).
- Felicio, L. S., Nelson, J. F., Finch, C. E. Longitudinal studies of estrous cyclicity in aging C57BL/6J mice: II. Cessation of cyclicity and the duration of persistent vaginal cornification. Biology of reproduction. 31, 446-453 (1984).
- Van Der Lee, S., Boot, L. M. Spontaneous pseudopregnancy in mice. II. Acta physiologica et pharmacologica Neerlandica. 5, 213-215 (1956).
- Van Der Lee, S., Boot, L. M. Spontaneous pseudopregnancy in mice. Acta physiologica et pharmacologica Neerlandica. 4, 442-444 (1955).
- Armaiz-Pena, G. N. Estrous cycle modulates ovarian carcinoma growth. Clinical cancer research : an official journal of the American Association for Cancer Research. 15, 2971-2978 (2009).
- Jemiolo, B., Harvey, S., Novotny, M. Promotion of the Whitten effect in female mice by synthetic analogs of male urinary constituents. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 83, 4576-4579 (1986).
