Определение газовой фазе кислотность олигопептидов
Summary
Определение газофазной кислотности цистеинсодержащий олигопептидов описано. Эксперименты проводили с использованием тройной квадрупольный масс-спектрометр. Относительное кислотности пептиды измеряют, используя столкновение-диссоциации, индуцированной экспериментов, и количественный кислотности определяются с помощью расширенного повара кинетического метода.
Abstract
Аминокислотные остатки, расположенные в различных местах в свернутых белков часто демонстрируют различную степень кислотности. Например, остаток цистеина расположены на или вблизи N-конца спирали, часто более кислой, чем на или вблизи С-конца 1-6. Несмотря на обширные экспериментальные исследования на кислотно-основные свойства пептидов были проведены в конденсированной фазе, в частности, в водных растворах 6-8, результаты часто осложняются эффекты растворителя 7. В действительности, большинство активных центров в белках находятся вблизи внутренней области, где растворитель эффекты были сведены к минимуму 9,10. Для того, чтобы понять внутреннюю кислотно-основные свойства пептидов и белков, важно, чтобы выполнить исследования растворителей среды.
Мы представляем метод для измерения кислотности олигопептидов в газовой фазе. Мы используем цистеинсодержащий олигопептиду, Ala 3 CysNH <sиЬ> 2 (CH 3) в качестве модельного соединения. Измерения основаны на устоявшихся расширенного Поваров кинетический метод (рис. 1) 11-16. Эксперименты проводили с использованием тройной квадрупольный масс-спектрометр сопряжена с ионизацией электрораспылением (ESI) источник ионов (рис. 2). Для каждого образца пептида, несколько кислот менее опасными. Опорный кислоты структурно подобны органических соединений с известной газовой фазе кислотности. Раствор смеси пептида и ссылки кислоту вводят в масс-спектрометр, и в газовой фазе протон-связанной анионной кластер пептид ссылки кислота образуется. Протон-связанного кластера массы изолированы, а затем фрагментирован через индуцированных столкновениями диссоциации (CID) экспериментов. Полученное содержаний фрагмент ионов анализировали с использованием отношения между кислотностью и кластерного иона кинетики диссоциации. Газофазных кислотность пептид затем obtaiНед линейной регрессии термокинетических участков 17,18.
Этот метод может быть применен к различным молекулярных систем, включая органические соединения, аминокислоты и их производные, олигонуклеотиды и олигопептидов. При сравнении газофазной кислотности измерена экспериментально с тем, рассчитанные для различных конформеров, конформационных эффектов на кислотность может быть оценена.
Introduction
Кислотности аминокислотные остатки являются одними из наиболее важных термохимических свойств, которые влияют на структуры, реакционной способности, а также складной-разворачивания процессов белков 9,19. Индивидуальные аминокислотные остатки часто показывают различные эффективные кислотности в зависимости от их расположения в белках. В частности, в остатках, расположенных в активных центрах часто демонстрируют значительно возмущенного кислотности. Одним из таких примеров является остаток цистеина, проживающих в активных центрах тиоредоксин супер-семейство ферментов 20,21. Активное цистеина сайта необычно кислой сравнению с теми в развернутых белков 3-5. Было высказано предположение о том, что спиральной конформации может иметь значительный вклад в необычном кислотности. Есть обширные экспериментальные исследования на кислотно-основные свойства пептидов проводили в растворе, особенно в водных растворах 2,6-8. Результаты были часто осложняется эффекты растворителя7. В действительности, большинство активных центров в белках находятся вблизи внутренней области, где растворитель эффекты минимизированы 9,10.
Для того, чтобы понять внутреннюю кислотно-основные свойства пептидов и белков, важно проводить исследования растворителей среды. Здесь мы вводим масс-спектрометрии метод, основанный на определении газовой фазе кислотность. Этот подход упоминается как расширенная повара кинетического метода. Этот метод был успешно применен к широкому спектру химических систем для определения различных термохимических свойств, таких как в газовой фазе кислотность, сродство протон, сродство ионов металлов, сродство к электрону и энергии ионизации 11-15 22-26. Мы применили этот метод для определения газовой фазы кислотности серии олиго-цистеин-полиаланином и цистеин-полиглицине пептидов 17,18,27. Эти исследования показывают, что N-концевой цистеин Peptidы значительно более кислой, чем соответствующий С-концевой них. Высокая кислотность бывшего, вероятно, вследствие спиральной конформационных эффектов, в которых анион тиолята сильно стабилизированные взаимодействие с спирали макро-диполь. Из-за энергонезависимой и термонеустойчивое природе пептидов, кинетический метод является наиболее практичным подходом доступных в настоящее время для получения достаточно точных кислотно-щелочного термохимической количеств пептидов 28.
Общая схема и уравнение связанных с кинетического метода показаны на рисунке 1. Определение газовой фазе кислотность пептид (AH) начинается с образованием ряда протон связанного кластерных анионов [A • H • г] ¯ (или [¯ • H + • я ¯] ¯) в ионном области источника в масс-спектрометр, где ¯ и я ¯ являются депротонированную формы пептида иопорный кислоты соответственно. Опорный кислот органических соединений с известной газовой фазе кислотности. Опорный кислоты должны иметь структуры похожи друг на друга (но не обязательно же, как пептид). Сходство между опорными структурами кислот обеспечивает сходство энтропии депротонирование среди них. Протон-связанного кластера анионы массы выбраны и активированы и столкновительно впоследствии диссоциированными использованием индуцированных столкновениями диссоциации (CID) эксперименты с получением соответствующего мономерных анионов, и ¯ ¯ я, с константами скорости К и К я, соответственно, как показано на рисунке 1а. Если вторичный фрагментации являются незначительными, относительное содержание CID фрагментарных ионов, [¯] / [я ¯], представляет собой приблизительную оценку отношение констант скорости, к / к я. В предположении, что нет обратной активированнойионных барьеров для диссоциации каналов CID ион продукт ветвления, Л. Н. [¯] / [я ¯], будет линейно коррелирует с газовой фазе кислотность пептид (Δ кислота H), и те из кислот ссылки (Δ кислоты H I), как показано на рисунке 1b. В этом уравнении Δ кислота H ср является средним газовой фазе кислотность ссылкой кислоты, Δ (Δ S)-энтропия термин (который можно считать постоянным, если ссылка кислоты являются структурно похожи друг на друга), R представляет Универсальная газовая постоянная, Т эфф эффективной температуры системы. Эффективная температура эмпирический параметр, зависящий от нескольких экспериментальных переменных, в том числе энергии столкновения.
Значение газовой фазе кислотность определяется путем построения двух наборов термо-кинетический участков. Первый набор наблюдаетсяполученные путем построения LN ([¯] / [Я ¯]) против Δ кислоты H I – Δ H Средняя кислоты, как показано на рисунке 4а. Линейная регрессия даст множество прямых с наклоном X = 1 / RT эфф и перехватывает у = – [Δ кислоты H – Δ кислоты H Средняя] / RT эфф – Δ (Δ S) / R. Второй набор участков получены путем построения в результате перехватывает (Y) из первого набора по сравнению с соответствующим склонов (X), как показано на фиг.4b. Линейная регрессия выпускает новую линию с наклоном кислоты H Δ – Δ H Средняя кислоты и перехват Δ (Δ S) / R. Значение Δ кислоты H Затем определяется по наклону и энтропийный член, Δ (Δ S), получается изперехват.
Эксперименты проводили с использованием тройной квадрупольный масс-спектрометр сопряжена с ионизацией электрораспылением (ESI) источник ионов. Схема масс-спектрометра показан на рисунке 2. CID Эксперименты проводились по массе выбора протон-связанного кластера анионов с первым блоком квадрупольного и дают им возможность пройти столкновений с атомами аргона просочилась в камере столкновений, который проводится при давлении от около 0,5 мТорр. Ионы диссоциации продукта массой проанализированы с третьего блока квадрупольного. CID спектры записаны на нескольких энергиях столкновения с м / з диапазон достаточно широк, чтобы охватить все возможные вторичные фрагменты. CID интенсивности ионного продукта измеряется путем установки инструмента в выбранной мониторинга реакции (SRM) режим, в котором сканирование сосредоточено на выбранных ионов продукта. CID Эксперименты проводились на четырех различных энергиях столкновения, соответствующихЦентр масс энергиях (Е см) 1.0, 1.5, 2.0 и 2.5 эВ соответственно. Центр масс энергии рассчитывается по следующей формуле: E = E см лаборатории [/ (м + м)], где E лаборатории энергия столкновения в лабораторной системе, т-масса аргона и М Масса протона связанного кластер ион.
В этой статье мы используем олигопептиду Ала 3 CysNH 2 (CH 3) в качестве модельного соединения. С-конец амидирован, а группа тиола (SH) остатка цистеина будет кислой сайта. Выбор подходящих кислот ссылка является важным для успешного измерений в газовой фазе кислотность. Идеальный кислоты ссылкой структурно подобны (друг на друга) органических соединений с хорошо известными в газовой фазе значений кислотности. Опорный кислоты должны иметь кислотность значений, близких к что пептидов. Для пептид 3 CH, шесть галогенированной карбоновойС кислот выбраны в качестве опорного кислот. Шесть кислот являются ссылкой хлоруксусную кислоты (MCAH), бромуксусную кислоты (Мбах), дифторуксусная кислоты (DFAH), дихлоруксусной кислоты (DCAH), dibromoacetic кислоты (DBAH) и трифторуксусной (TFAH). Двое из них, и DFAH Мбах, будет использоваться для иллюстрации работы протокола.
Protocol
Representative Results
Discussion
Успешное измерение в газовой фазе кислотность пептида, в значительной степени зависит от выбора подходящих кислот ссылки. Идеальный кислот ссылкой структурно сходные органические соединения с хорошо известными в газовой фазе значений кислотности. Опорный кислоты должны иметь сходн?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Mass Spectrometer | Varian | 1200 L and 320 L | |
| Chloroacetic acid | Sigma-Aldrich | 402923 | |
| Bromoacetic acid | Sigma-Aldrich | B56307 | |
| Difluoroacetic acid | Sigma-Aldrich | 142859 | |
| Dichloroacetic acid | Sigma-Aldrich | D54702 | |
| Dibromoacetic acid | Sigma-Aldrich | 242357 | |
| Trifluoroacetic acid | Sigma-Aldrich | T6508 |
References
- Forsyth, W. R., Antosiewicz, J. M., Robertson, A. D. Empirical relationships between protein structure and carboxyl pKa values in proteins. Proteins: Struct. Funct. Genet. 48 (2), 388-403 (2002).
- Huyghues-Despointes, B. M. P., Scholtz, J. M., Baldwin, R. L. Effect of a single aspartate on helix stability at different positions in a neutral alanine-based peptide. Protein Sci. 2 (10), 1604-1611 (1993).
- Takahashi, N., Creighton, T. E. On the Reactivity and Ionization of the Active Site Cysteine Residues of Escherichia coli Thioredoxin. Biochemistry. 35 (25), 8342-8353 (1996).
- Gan, Z. R., Sardana, M. K., Jacobs, J. W., Polokoff, M. A. Yeast thioltransferase – the active site cysteines display differential reactivity. Archives of Biochemistry and Biophysics. 282 (1), 110-115 (1990).
- Philipps, B., Glockshuber, R. Randomization of the Entire Active-site Helix alpha 1 of the Thiol-disulfide Oxidoreductase DsbA from Escherichia coli. J. Biol. Chem. 277 (45), 43050-43057 (2002).
- Joshi, H. V., Meier, M. S. The effect of a peptide helix macrodipole on the pKa of an Asp side chain carboxylate. J. Am. Chem. Soc. 118, 12038-12044 (1996).
- Kortemme, T., Creighton, T. E. Ionization of cysteine residues at the termini of model α-helical peptides. Relevance to unusual thiol pKa values in proteins of the thioredoxin family. J. Mol. Biol. 253 (5), 799-812 (1995).
- Gallo, E. A., Gellman, S. H. Effect of a C-Terminal Cationic Group on the Competition between α-Helical Turn and β-Turn in a Model Depsipeptide. J. Am. Chem. Soc. 116 (25), 11560-11561 (1994).
- Honig, B., Nicholls, A. Classical electrostatics in biology and chemistry. Science. 268 (5214), 1144-1149 (1995).
- Warshel, A. Electrostatic basis of structure-function correlation in proteins. Acc. Chem. Res. 14 (9), 284-290 (1981).
- Cooks, R. G., Patrick, J. S., Kotiaho, T., McLuckey, S. A. Thermochemical determinations by the kinetic method. Mass Spectrom. Rev. 13 (4), 287-339 (1994).
- Cooks, R. G., Koskinen, J. T., Thomas, P. D. The kinetic method of making thermochemical determinations. J. Mass Spectrom. 34 (2), 85-92 (1999).
- Cheng, X., Wu, Z., Fenselau, C. Collision Energy Dependence of Proton-Bound Dimer Dissociation: Entropy Effects, Proton Affinities, and Intramolecular Hydrogen-Bonding in Protonated Peptides. J. Am. Chem. Soc. 115 (11), 4844-4848 (1993).
- Cerda, B. A., Wesdemiotis, C. Li+, Na+, and K+ Binding to the DNA and RNA Nucleobases. Bond Energies and Attachment Sites from the Dissociation of Metal Ion-Bound Heterodimers. J. Am. Chem. Soc. 118 (47), 11884-11892 (1996).
- Cooks, R. G., Wong, P. S. H. Kinetic Method of Making Thermochemical Determinations: Advances and Applications. Acc. Chem. Res. 31 (7), 379-386 (1998).
- Armentrout, P. B. Entropy Measurements and the Kinetic Method: a Statistically Meaningful Approach. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 11 (5), 371-379 (2000).
- Ren, J., Tan, J. P., Harper, R. T. Gas-Phase Acidities of Cysteine-Polyalanine Peptides I: A3,4CSH and HSCA3,4. J. Phys. Chem. A. 113 (41), 10903-10912 (2009).
- Morishetti, K. K., Huang, B. D. S., Yates, J. M., Ren, J. Gas-Phase Acidities of Cysteine-Polyglycine Peptides: The Effect of the Cysteine Position. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 21 (4), 603-614 (2010).
- Fersht, A. . Structure and mechanism in protein science. , (1999).
- Martin, J. L. Thioredoxin-a fold for all reasons. Structure. 3 (3), 245-250 (1995).
- Carvalho, A. P., Fernandes, P. A., Ramos, M. J. Similarities and Differences in the Thioredoxin Superfamily. Progress in Biophysics & Molecular Biology. 91 (3), 229-248 (2006).
- Bouchoux, G., Sablier, M., Berruyer-Penaud, F. Obtaining Thermochemical Data by the Extended Kinetic Method. J. Mass Spectrom. 39 (9), 986-997 (2004).
- Bouchoux, G., Desaphy, S., Bourcier, S., Malosse, C., Bimbong, R. N. B. Gas-Phase Protonation Thermochemistry of Arginine. J. Phys. Chem. B. 112 (11), 3410-3419 (2008).
- Bouchoux, G., Bimbong, R. N. B., Nacer, F. Gas-Phase Protonation Thermochemistry of Glutamic Acid. J. Phys. Chem. A. 113 (24), 6666-6676 (2009).
- Zheng, X., Cooks, R. G. Thermochemical Determinations by the Kinetic Method with Direct Entropy Correction. J. Phys. Chem. A. 106 (42), 9939-9946 (2002).
- Jones, C. M., Bernier, M., Carson, E., Colyer, K. E., Metz, R., Pawlow, A., Wischow, E. D., Webb, I., Andriole, E. J., Poutsma, J. C. Gas-phase acidities of the 20 protein amino acids. Int. J. Mass Spectrom. 267 (1-3), 54-62 (2007).
- Tan, J. P., Ren, J. Determination of the Gas-Phase Acidities of Cysteine-Polyalanine Peptides Using the Extended Kinetic Method. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 18 (2), 188-194 (2007).
- Harrison, A. G. The gas-phase basicities and proton affinities of amino acids and peptides. Mass Spectrom. Rev. 16 (4), 201-217 (1997).
- Gutte, B. . Peptides: Synthesis, Structures, and Applications. , (1995).
- Barany, G., Merrifield, R. B. Solid-phase peptide synthesis. The Peptides. 2, 1-284 (1979).
- Chan, W. C., White, P. D. . Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis: A Practical Approach. , (2000).
