Progenitor afgeleide oligodendrocyt Cultuur System van menselijke foetale hersenen
Summary
Primaire, menselijke foetale hersenen-afgeleide, multipotentiële progenitorcellen vermenigvuldigen<em> In vitro</em> Terwijl de kunnen differentiëren tot neuronen en astrocyten. Hieruit blijkt dat neurale stamcellen kunnen worden geïnduceerd door stadia van de oligodendrocytic lineage onderscheiden door conditionering met bepaalde groeifactoren.
Abstract
Differentiatie van humane neurale stamcellen in neuronale en gliale celtypen een model te bestuderen en vergelijken moleculaire regulatie van neurale cellijn ontwikkeling. In vitro expansie van neurale voorlopercellen uit foetale CZS-weefsel is goed gekarakteriseerd. Ondanks de identificatie en isolatie van gliale voorlopercellen uit volwassen menselijk subcorticale witte stof en ontwikkeling van verschillende kweekomstandigheden direct differentiatie van neurale stamcellen in myeline producerende oligodendrocyten, het verkrijgen van voldoende menselijke oligodendrocyten in vitro experimenten blijft moeilijk. Differentiatie van galactocerebroside + (GalC) en O4 + oligodendrocyt precursor of progenitorcellen (OPC) van neurale precursoren is gemeld met behulp van het tweede trimester foetale hersenen. Echter, deze cellen niet prolifereren in afwezigheid van steuncellen zoals astrocyten en neuronen en worden snel verloren tijd in cultuur. De noodzaak de een kweeksysteem te produceren cellen van de oligodendrocyten lineage geschikt voor in vitro experimenten.
Kweek van primaire humane oligodendrocyten kan bijvoorbeeld een nuttig model voor de pathogenese van neurotrope ziekteverwekkers zoals het menselijk polyomavirus, JCV dat in vivo infecteert deze cellen te bestuderen. Deze gekweekte cellen kunnen ook modellen van andere demyeliniserende ziekten van het centrale zenuwstelsel (CNS). Primaire, foetale hersenen afgeleide, multipotentiële neurale progenitorcellen prolifereren in vitro terwijl de kunnen differentiëren tot neuronen (progenitor-afgeleide neuronen, PDN) en astrocyten (progenitor-afgeleide astrocyten, PDA) Dit onderzoek toont dat neurale stamcellen kunnen worden geïnduceerd om onderscheid te maken door veel van de stadia van oligodendrocytic afkomst ontwikkeling (progenitor-afgeleide oligodendrocyten, BOB). We cultuur neurale stamcellen in DMEM-F12 serumvrije media supaangevuld met basic fibroblast growth factor (bFGF), van bloedplaatjes afkomstige groeifactor (PDGF-AA), Sonic hedgehog (Shh), neurotrofische factor 3 (NT-3), N-2 en triiodothyronine (T3). De gekweekte cellen worden gepasseerd op 2.5e6 cellen per 75cm kolven ongeveer om de zeven dagen. Met deze omstandigheden is de meerderheid van de cellen in cultuur te behouden morfologie wordt gekenmerkt door een aantal processen en een automatische markers vooraf oligodendrocyt cellen, zoals A2B5 en O-4. Wanneer we de vier groeifactoren (GF) (bFGF, PDGF-AA, Shh, NT-3) verwijderen en toevoegen geconditioneerde media uit PDN, de cellen beginnen te meer processen en express markers specifiek voor oligodendrocyten differentiatie, als GalC en myeline verwerven basic protein (MBP). We fenotypische karakterisatie uitgevoerd met multicolor flowcytometrie unieke markers van oligodendrocyt identificeren.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dit protocol wordt beschreven hoe u foetale oligodendrocyten ontlenen primaire menselijke neurale stamcellen en karakteriseren hun fenotype met behulp van zowel flowcytometrie en immunofluorescentie kleuring. De uitbreiding en groei van neurale voorlopercellen uit foetale centrale zenuwstelsel is zeer goed beschreven 1-4. Echter, om voldoende menselijke oligodendrocyten in vitro experimenten blijft moeilijk, hoewel het mogelijk om voorlopers en gliale isoleren van volwassen menselijke witte stof <sup…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit onderzoek werd ondersteund door de Intramurale Research Program van de National Institutes of Health, NINDS. De auteurs willen graag alle leden van het Laboratorium voor Moleculaire Geneeskunde en Neuroscience, Rick Dreyfuss bedanken voor het helpen met microscopie en Pamela C. Zeven voor het helpen met de redactie.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Final concentration | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| DME/HAMS F12 1:1 | Omega Scientist | DM-251 | 1X | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Bovine Albumin | Sigma | A9418 | 1% | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Gentamicin | Quality Biologicals | 120-098-031 | 50 μg/ml | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| L-Glutamine | Quality Biologicals | 118-084-061 | 2 mM | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| T3 | Sigma | T2877 | 3 nM | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| N2 Components | Gibco BRL | 17502 | 1:100 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| NT-3 | PeproTech Inc | 450-03 | 2 ng/ml | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Shh | R&D System | 1314-SH/CF | 2 ng/ml | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| bFGF | PeproTech Inc | 100-18B | 20 ng/ml | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| PDGF-AA | PeproTech Inc | 100-13A | 10 ng/ml | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| PDL | Sigma | P6407 | 50 μg/m | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| PFA | Electron Microscopy Sciences | 15712 | 2% | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Trypsin | Quality Biologicals | 118-087-721 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Papain | Worthington | LK003178 | 20 U/ml | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| DNase vials | Worthington | LK003172 | 0.005% | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| EBSS | Worthington | LK003188 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| ProLong Gold with DAPI |
Invitrogen | P36931 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Table 1. Reagents. |
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Table 2. Antibodies (Abs) used for flow cytometry and immunocytochemistry assays. Antibody conjugates: PE, phycoerythrin; PETR, phycoerythrin Texas Red; AMCA, amino-methyl-coumarin-acetate; Cy, cyanine; FITC, fluorescein isothiocyanate. Ig: immunoglobulin. AF: Alexa Fluor; gαm: goat anti-mouse; gαrb: goat anti-rabbit; dαck: donkey anti-chicken. |
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
References
- Messam, C. A., Hou, J., Gronostajski, R. M., Major, E. O. Lineage pathway of human brain progenitor cells identified by JC virus susceptibility. Ann. Neurol. 53, 636-646 (2003).
- Vescovi, A. L., Reynolds, B. A., Fraser, D. D., Weiss, S. bFGF regulates the proliferative fate of unipotent (neuronal) and bipotent (neuronal/astroglial) EGF-generated CNS progenitor cells. Neuron. 11, 951-966 (1993).
- Johe, K. K., Hazel, T. G., Muller, T., Dugich-Djordjevic, M. M., McKay, R. D. Single factors direct the differentiation of stem cells from the fetal and adult central nervous system. Genes Dev. 10, 3129-3140 (1996).
- McKay, R. Stem cells in the central nervous system. Science. 276, 66-71 (1997).
- Belachew, S., et al. Postnatal NG2 proteoglycan-expressing progenitor cells are intrinsically multipotent and generate functional neurons. J. Cell Biol. 161, 169-186 (2003).
- Almazan, G., McKay, R. An oligodendrocyte precursor cell line from rat optic nerve. Brain Res. 579, 234-245 (1992).
- Filipovic, R., Zecevic, N. Neuroprotective role of minocycline in co-cultures of human fetal neurons and microglia. Exp. Neurol. 211, 41-51 (2008).
- Goldman, S. A., Natesan, S. A niche-defying feat: induced oligoneogenesis in the adult dentate gyrus. Cell Stem Cell. 3, 125-126 (2008).
- Nunes, M. C., et al. Identification and isolation of multipotential neural progenitor cells from the subcortical white matter of the adult human brain. Nat. Med. 9, 439-447 (2003).
- Lyssiotis, C. A., et al. Inhibition of histone deacetylase activity induces developmental plasticity in oligodendrocyte precursor cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 14982-14987 (2007).
- Sim, F. J., Goldman, S. A. White matter progenitor cells reside in an oligodendrogenic niche. Ernst Schering Res. Found Workshop. , 61-81 (2005).
- Raff, M. C., Miller, R. H., Noble, M. A glial progenitor cell that develops in vitro into an astrocyte or an oligodendrocyte depending on culture medium. Nature. 303, 390-396 (1983).
- Windrem, M. S., et al. Progenitor cells derived from the adult human subcortical white matter disperse and differentiate as oligodendrocytes within demyelinated lesions of the rat brain. J. Neurosci. Res. 69, 966-975 (2002).
- Chen, Y., et al. Isolation and culture of rat and mouse oligodendrocyte precursor cells. Nat. Protoc. 2, 1044-1051 (2007).
- Armstrong, R. C. Isolation and characterization of immature oligodendrocyte lineage cells. Methods. 16, 282-292 (1998).
- Hu, B. Y., Du, Z. W., Li, X. J., Ayala, M., Zhang, S. C. Human oligodendrocytes from embryonic stem cells: conserved SHH signaling networks and divergent FGF effects. Development. 136, 1443-1452 (2009).
- Gard, A. L., Williams, W. C., Burrell, M. R. Oligodendroblasts distinguished from O-2A glial progenitors by surface phenotype (O4+GalC-) and response to cytokines using signal transducer LIFR beta. Dev. Biol. 167, 596-608 (1995).
- Hu, B. Y., Du, Z. W., Zhang, S. C. Differentiation of human oligodendrocytes from pluripotent stem cells. Nat. Protoc. 4, 1614-1622 (2009).
- Reubinoff, B. E., et al. Neural progenitors from human embryonic stem cells. Nat. Biotechnol. 19, 1134-1140 (2001).
- Pfeiffer, S. E., Warrington, A. E., Bansal, R. The oligodendrocyte and its many cellular processes. Trends Cell Biol. 3, 191-197 (1993).
- Zhang, S. C., Ge, B., Duncan, I. D. Tracing human oligodendroglial development in vitro. J. Neurosci. Res. 59, 421-429 (2000).
- Bradl, M., Lassmann, H. Oligodendrocytes: biology and pathology. Acta Neuropathol. 119, 37-53 (2010).
- Chong, S. Y., Chan, J. R. Tapping into the glial reservoir: cells committed to remaining uncommitted. J. Cell Biol. 188, 305-312 (2010).
- Jakovcevski, I., Filipovic, R., Mo, Z., Rakic, S., Zecevic, N. Oligodendrocyte development and the onset of myelination in the human fetal brain. Front Neuroanat. 3, 5 (2009).
- Rao, R. C., Boyd, J., Padmanabhan, R., Chenoweth, J. G., McKay, R. D. Efficient serum-free derivation of oligodendrocyte precursors from neural stem cell-enriched cultures. Stem Cells. 27, 116-125 (2009).
- D’Intino, G., et al. Triiodothyronine administration ameliorates the demyelination/remyelination ratio in a non-human primate model of multiple sclerosis by correcting tissue hypothyroidism. J. Neuroendocrinol. 23, 778-790 (2011).
- Cui, Q. L., et al. Human fetal oligodendrocyte progenitor cells from different gestational stages exhibit substantially different potential to myelinate. Stem Cells Dev. , (2012).
- Messam, C. A., Hou, J., Major, E. O. Coexpression of nestin in neural and glial cells in the developing human CNS defined by a human-specific anti-nestin antibody. Exp. Neurol. 161, 585-596 (2000).
