Fetal Fare Visseral Organlardan Otonom Sinir progenitörlerin Floresans aktive Hücre Sıralama (FACS) İzolasyon için bir optimize Prosedürü
Summary
Fetal fare dokulardan nöral krest kaynaklı nöronal ataları arındırmak için optimize edilmiş bir prosedür anlatılmıştır. Bu yöntem, floresan ile aktive olan hücre sıralama (FACS) tarafından ayrı nüfus yalıtmak için floresan muhabiri allellerinin ifade yararlanır. Tekniğin geliştirilmesi boyunca veya yetişkin dokulardan nöronal subpopülasyonunun izole etmek için uygulanabilir.
Abstract
Geliştirme nöral krest (NC) sırasında kaynaklı nöronal ataları bağırsak ve alt üriner sistem gibi iç organlarda otonomik gangliyonlar oluşturmak için nöral tüp uzağa göç. Lazer yakalama mikro diseksiyon gibi yöntemleri kullanarak ayrık nüfusların izolasyon zordur bu nedenle gelişimi sırasında ve olgun dokularda hem bu hücreler sıklıkla yaygın doku boyunca dağılmış bulunmaktadır. Onlar ancak Tirozin hidroksilaz (TH) gibi nöron spesifik genlerin düzenleyici bölgelerden sürülen floresan gazetecilere ifadesi doğrudan görüntülenebilmekte. Biz canlı TH yüksek verim + bağırsak ve bölünmeler ve floresan aktive hücre sıralama (FACS) dayalı alt üriner sistem (LUT) dahil fetal fare viseral dokular, gelen nöronal ataları için optimize edilmiş bir metodu tanımlar.
Pe geni katekolaminlerin üretimi için hız sınırlama enzimi kodlayan. Enterik nöronal progenitörlerin TH dur ifade etmeye başlayacakfetal intestinal 1 ve TH onların göç ing de yetişkin pelvik ganglion nöronlar 2-4 bir alt kümesi mevcuttur. Bu soy ve bu LUT diğer yönlerine nöronlar ve bunların izolasyon dağılımının ilk görünümü tarif edilmemiştir. TH ifade Nöronal ataları transgen yapı Tg (Th-EGFP) DJ76Gsat/Mmnc 1 taşıyan farelerde EGFP ifade ile kolayca görüntülenebilmekte. Biz 0.5 DPC olarak fiş algılama sabah tayin, 15.5 gün sonrası cinsel birleşme (DPC) de gelişmekte LUT olarak TH dağıtım + hücreler belgelemek için fetal farelerde bu transgen ifade görüntülendi ve gözlenen coalescing nöronal ataları bir alt pelvik ganglion ekspres EGFP.
LUT TH + nöronal ataları izole etmek için, başlangıçta fetal fare bağırsak 2-6 nöral krest kök hücreleri arındırmak için kullanılan yöntemlerin optimize edilmiş. Dayanılmıştır NC-türetilmiş nüfus izole önce çabalarıAkım sitometri için hücre süspansiyonları elde etmek kollajenaz ve tripsin bir kokteyl ile sindirim. Elimizdeki bu yöntemler nispeten düşük canlılığı ile LUT gelen hücre süspansiyonları üretti. Fetal LUT dokularda nöronal progenitörlerin zaten düşük insidansı göz önüne alındığında, son ayrışmaktadır hücre sağkalım artış olacağı gibi ayrışma yöntemleri optimize etmek için yola çıktı. Bizi aşağı analiz için yeterli nöronal progenitörlerin sonraki verimleri ile sürekli daha fazla yaşama (toplam hücrelerinin>% 70) elde etmek için izin düşük basınçta sıralama bu nazik Accumax DİSOSİASYON (Yenilikçi Cell Technologies, Inc), otomatik filtreleme, ve akış belirlenir. Bu tarif yöntemi genel olarak fetal veya yetişkin için mürin dokular ya gelen nöronal popülasyonlarının çeşitli izole etmek için uygulanabilir.
Protocol
Discussion
Floresan gazetecilere ifade Fare muhabiri hatları fare genetik topluluk 1,8,9 birden fazla çabalarıyla yaygın olarak kullanılabilir hale gelmektedir. Bunun sonucu olarak Burada gösterilen çözünme yöntemi yaygın fetal veya yetişkin dokular ya gelen nörotransmiter veya reseptör salgılanma modellerini dayalı kesikli nöronal alt tiplerinin izolasyon için uygulanabilir. Bir flüoresan raportör transgen ifade göre bu yöntem optimize edilmiş olmakla birlikte, aynı zamanda hücrenin canlı imm?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar resimli sanatsal yardım için Vanderbilt Üniversitesi Tıp Merkezi ve Melissa A. Musser az Akım Sitometri Paylaşılan Kaynak destek için hücre bölünme yöntemleri ve Kevin Weller, David Flaherty ve Brittany Matlock önerileri için Catherine Alford teşekkür etmek istiyorum. Biz Dr teşekkür ederim. Nöronal progenitörlerin izolasyon uygulanması konusunda tavsiye için Jack Mosher ve Sean Morrison. VMC Akım Sitometri Paylaşılan Kaynak Vanderbilt Ingram Kanser Merkezi (P30 CA68485) ve Vanderbilt Sindirim Hastalıkları Araştırma Merkezi (P30 DK058404) tarafından desteklenmektedir. Bu çalışma Sağlık hibe DK064251, DK086594 ve DK070219 ABD Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından finanse tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Reagent Name | Vendor | Catalog number | Comments |
| Accumax | Sigma(mfr: Innovative Cell Technologies) | A7089-100ML | Store frozen in 1 ml aliquots |
| DNase I | Sigma | D-4527 | Stored frozen at -20 °C 5 mg/ml in 1xHBSS, (Used in Quench, Quench 1:5) |
| 10X PBS pH 7.4 | Gibco | 70011-044 | Make up to 1x with tissue culture grade water then sterile filter |
| 10X HBSS w/o Ca or Mg | Gibco | 14185-052 | Make up to 1x with tissue culture grade water then sterile filter |
| Leibovitz’s L-15 medium | Gibco | 21083027 | |
| Penicillin /Streptomycin 100X | Gibco | 15140-133 | Store aliquoted at -20 °C |
| BSA | Sigma | A3912-100G | Store aliquoted at -20 °C, 100 mg/ml in water |
| Biowhittaker 1M HEPES in 0.85% NaCl | Lonza | 17-737E | |
| 38 μm NITEX Nylon Mesh Membrane | Sefar America | 3-38/22 | Cut into ~3 cm squares. UV treat overnight to sterilize in the tissue culture hood. |
| 7-AAD | Invitrogen | A1310 | 1 mg/ml |
| TRIzol LS | Invitrogen | 10296-028 | |
| 5 ml polystyrene tubes | Falcon | 352058 | |
| 15 ml conical tubes | Corning | 430790 | |
| Fine Dissecting Forceps | Fine Science Instruments | 11251-30 | Dumont#5 forcep, Dumoxel, standard tip 0.1×0.06mm |
| Dissecting Spoon | Fine Science Instruments | 10370-18 |
References
- Gong, S. A gene expression atlas of the central nervous system based on bacterial artificial chromosomes. Nature. 425, 917-925 (2003).
- Morrison, S. J., White, P. M., Zock, C., Anderson, D. J. Prospective identification, isolation by flow cytometry, and in vivo self-renewal of multipotent mammalian neural crest stem cells. Cell. 96, 737-749 (1999).
- Kruger, G. M. Neural crest stem cells persist in the adult gut but undergo changes in self-renewal, neuronal subtype potential, and factor responsiveness. Neuron. 35, 657-669 (2002).
- Bixby, S., Kruger, G. M., Mosher, J. T., Joseph, N. M., Morrison, S. J. Cell-intrinsic differences between stem cells from different regions of the peripheral nervous system regulate the generation of neural diversity. Neuron. 35, 643-656 (2002).
- Walters, L. C., Cantrell, V. A., Weller, K. P., Mosher, J. T., Southard-Smith, E. M. Genetic background impacts developmental potential of enteric neural crest-derived progenitors in the Sox10Dom model of Hirschsprung disease. Human Molecular Genetics. , (2010).
- Corpening, J. C. Isolation and live imaging of enteric progenitors based on Sox10-Histone2BVenus transgene expression. Genesis. 49, 599-618 (2011).
- Morrison, S. J. . Isolation of fetal rat neural crest stem cells (NCSC) from gut and sciatic nerve. , (2012).
- Skarnes, W. C. A conditional knockout resource for the genome-wide study of mouse gene function. Nature. 474, 337-342 (2011).
- Harding, S. D. The GUDMAP database–an online resource for genitourinary research. Development. 138, 2845-2853 (2011).
- Joseph, N. M. Enteric glia are multipotent in culture but primarily form glia in the adult rodent gut. J. Clin. Invest. 121, 3398-3411 (2011).
- Newgreen, D. F., Murphy, M. Neural crest cell outgrowth cultures and the analysis of cell migration. Methods Mol. Biol. 137, 201-211 (2000).
