堅牢な、小規模のHeLa細胞核抽出物を調製するためのプロトコルが記述されています。このプロトコルはそのような薬剤又はRNAi処理した細胞などの細胞の小集団の使用を必要とするアッセイのために貴重なものです。方法は、患者の細胞を含む遺伝子発現アッセイおよび他の細胞さまざまな種類のに適用する必要があります。
を理解する遺伝子発現の大きな進歩は 、in vitro 系で使用して行われました。ほとんどの研究では、機能アッセイは、懸濁液で培養した細胞の10〜50以上リットルから大量に調製される抽出物を用いて行われている。しかし、これらの大規模な準備が急速に生体細胞の治療法や条件での様々な結果からそのin vitroでの効果をテストするに従順ではありません。このジャーナルのビデオ記事では、例としてHeLa細胞を用いて、機能的な小規模の核抽出物を調製するための方法を示しています。このメソッドは、接着単層として培養した細胞のようにいくつかの150 3 mmのプレートを用いて行われる。小規模の抽出の効率を示すために、我々は、彼らが結合されたRNAポリメラーゼII転写/スプライシング反応のバルク核抽出物のようにアクティブであることを示している。抽出プロトコルの有用性を実証するために、我々はスプライシングがHeLa細胞から調製した抽出物中に廃止されていることを示すsはスプライシング阻害薬E7107で処理した。小規模なプロトコルは、細胞抽出物を用いてin vitro で調べることができ、任意のプロセスまたは細胞型に一般的に適用する必要があります。これらは、小細胞集団の使用を必要とする薬剤、DNA損傷剤は、RNAi、またはトランスフェクション、など多くの薬剤にさらされる限られた量または細胞内でのみ利用可能です患者の細胞が含まれています。さらに、新たに培養した細胞の少量の便利な、そして/または、一部のアプリケーションで必要となります。
我々は、単層として成長したHeLa細胞の少量からの核抽出物を調製するための迅速かつ再現性のある方法を確立しています。我々は、これらの抽出物はRNAP II転写/スプライシングアッセイの動態と効率が小規模とバルク核抽出物と同様であることを示すことによって、堅牢であることを実証した。我々はスプライシング阻害薬で処理した細胞から調製した抽出物は、転写の活性が選択的スプライシングの欠陥であることを示すことによって、抽出の有用性を示した。
小規模の核抽出物を調製するために我々の手法は、以前大規模な1,8の懸濁液中で増殖させたHeLa細胞から抽出し、抽出し9の小規模な製造方法を作るために確立された方法を組み合わせて最適化することによって設立されました。前の小規模な抽出物はいくつかのアッセイのための機能ではなかったので、私たちはそのような結合転写/ SPのように、我々のプロトコルを確立しアッセイをlicing。前の小規模なプロトコル9と我々の重要な違いは、以前のプロトコルは小さなゲージの針9を介してそれらを押すことによって細胞を溶解したのに対し、我々はミニダウンスを用いて細胞を溶解するための条件を最適化することである。抽出物は、いくつかのアッセイのために再現することが非アクティブおよび/または困難であった理由を説明することが気泡の針溶解の結果、。我々はまたプロトコルへの濃縮工程を追加しました。このステップでは、濃度に非常に敏感で抽出、の活性を増加し、また、小規模の準備に固有である抽出の間にばらつきが制限されます。最後に、私たちの準備が日常的に大量の抽出物と比較して、活動に重要な影響を与えることなく、単層細胞の3つのみ150ミリメートルのプレートを用いて実施される。したがって、プロシージャは高価な試薬や限られた細胞の可用性を必要とする小規模の準備のために容易に適している。たとえば、我々は、SMAを用意しましたLL-スケールのRNAiノックダウン細胞から慢性リンパ性白血病(CLL)患者の細胞から抽出し、機能的および/または生化学的アッセイ(EGF、JLH、TYとRR、未発表)のためにこれらの抽出物を使用していました。我々は、抽出物は、そのようなimmunopreciptations、西部、および銀染色などの特定の生化学的アッセイ、続いてRNAiに貴重であることを見出した。特定のタンパク質をノックダウンの有効性を確立した後、より詳細な研究は、低コストで追加の抽出物を調製するために使用することができ、安定したノックダウン細胞株を作ることによって行うことができる。これらのノックダウン細胞株から得られた免疫沈降物中に存在するタンパク質の質量分析は、メソッドの有用なアプリケーションになります。ここで我々のプロトコルを記述するための例として使用した結合転写/スプライシングアッセイに加えて、小規模の抽出物は、さまざまな世紀に使用されるものとして、多くの機能や生化学的アッセイに一般的に適用する必要があります遺伝子発現のEPS(キャッピング、スプライシング、転写、ポリアデニル化、microRNAの処理など)。プロトコルはまた、いずれかの懸濁液中で得られた(例えば、CLL細胞など)、または(例えば、患者の線維芽細胞など)を培養で増殖することができ、患者の細胞型に適応することができます。最後に、プロシージャの間に得られた細胞質画分は細胞質を必要とする機能や生化学的アッセイの両方に有用であることが分かるはずです。
The authors have nothing to disclose.
我々は、有用な議論M. Winkelbauer·ハート、E.イブラヒム、P.バレンシア、K. Dufu、H.チェンに感謝しています。 HeLa細胞は、ナショナル細胞培養センター(ミネアポリス、MN)から得られた。また、光学顕微鏡のヘルプはハーバードメディカルスクールでE7107とニコンイメージングセンターを提供するためにエーザイ株式会社に感謝します。この作品は、JLHにRRとEGFとNRSAフェローシップにNIHの助成金GM043375によってサポートされていました。
Name of the reagent | Full name of reagent | Company | Catalogue number |
HEPES | 4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid | Sigma | H3375-500G |
MgCl2.6H2O | Magnesium Chloride Hexahydrate | Sigma | M2670-500G |
KCl | Potassium Chloride | Fisher | P335-212 |
PMSF | Phenylmethanesulfonyl fluoride | Sigma | P7626-100G |
DTT | Dithiothreitol | American Bioanalytical | AB00490-5G |
EDTA | Ethylenediaminetetraacetate, disodium, dihydrate | American Bioanalytical | AB00500-01000 |
Glycerol | MP Biomedicals | 800689 | |
DMEM | Dulbecco’s Minimal Essential Medium | Invitrogen | 11995-073 |
FBS | Fetal Bovine Serum | Gibco | 16140 |
Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15070 | |
PBS | Phosphate Buffered Saline | Cellgro | 21-040-CV |
Trypan Blue Stain 0.4% | Gibco | 15250 | |
Cell Lifters | Corning | 29442-200 | |
150mm Plates | VWR | 353025 | |
Extended Micropipette Tip | Denville | P1126 | |
Dounce homogenizer, 1ml, with tight pestle | Wheaton | 357538 | |
Slidealyzers, MWCO 10kDa | ThermoScientific | 69572 | |
Mini-Centricons, MWCO 3kDa | Millipore (Amicon) | UFC500396 |
Table 1. Specific Reagents and Equipment.
Solution | Final | Stock | Dispense |
Hypotonic | 10 mM HEPES, pH 7.9 | 1M HEPES, pH 7.9 | 5 ml |
1.5 mM MgCl2 | 1M MgCl2 | 750 μl | |
10 mM KCl | 3M KCl | 1.67 ml | |
0.2 mM PMSF | 200 mM PMSF | 500 μl | |
0.5 mM DTT | 2M DTT | 125 μl | |
Bring up to 500 ml with water | |||
Low Salt | 20 mM HEPES, pH 7.9 | 1M HEPES, pH 7.9 | 2 ml |
1.5 mM MgCl2 | 1M MgCl2 | 150 μl | |
20 mM KCl | 3M KCl | 667 μl | |
0.2 mM EDTA | 0.5M EDTA | 40 μl | |
25% Glycerol | Glycerol | 25 ml | |
0.2 mM PMSF | 200 mM PMSF | 100 μl | |
0.5 mM DTT | 2M DTT | 25 μl | |
Bring up to 100 ml with water | |||
High Salt | 20 mM HEPES, pH 7.9 | 1M HEPES, pH 7.9 | 2 ml |
1.5 mM MgCl2 | 1M MgCl2 | 150 μl | |
1.4M KCl | 3M KCl | 48 ml | |
0.2 mM EDTA | 0.5M EDTA | 40 μl | |
25% Glycerol | Glycerol | 25 ml | |
0.2 mM PMSF | 200 mM PMSF | 100 μl | |
0.5 mM DTT | 2M DTT | 25 μl | |
Bring up to 100 ml with water | |||
Dialysis | 20 mM HEPES, pH 7.9 | 1M HEPES, pH 7.9 | 10 ml |
100 mM KCl | 3M KCl | 16.625 ml | |
0.2 mM EDTA | 0.5M EDTA | 200 μl | |
20% Glycerol | Glycerol | 100 ml | |
0.2 mM PMSF | 200 mM PMSF | 500 μl | |
0.5 mM DTT | 2M DTT | 125 μl | |
Bring up to 500 ml with water |
Table 2. Solutions for Nuclear Extract Preparation.