JoVE Journal > Medicine
Summary
Abstract
Protocol
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Deutsch

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Medicine

NADH Fluoreszenz-Imaging von isolierten biventrikulären Arbeiten Kaninchenherzen

Published: July 24, 2012
doi:
10.3791/4115
, , , ,
1Electrical and Computer Engineering Department,The George Washington University, 2Pharmacology and Physiology Department,The George Washington University

Summary

Ziel ist es, die mitochondriale Redoxzustand isolierten Herzen im Rahmen der physiologischen und Nachlast Drücke überwachen. Ein biventrikulären arbeiten Kaninchen Herzen Modell vorgestellt. Örtlichen und zeitlichen Auflösung Fluoreszenz-Bildgebung von NADH wird verwendet, um die mitochondriale Redoxzustand Epikardgewebe überwachen.

Abstract

Seit der Gründung von Langendorff 1, bleibt die isoliert perfundierten Herzen ein prominentes Werkzeug zur Untersuchung der kardialen Physiologie 2. Es wird jedoch nicht für die Untersuchung der kardialen Metabolismus, die das Herz auf der Arbeit im Kontext der physiologischen Vor-und Nachlast Druck durchzuführen erfordern gut geeignet. Neely eingeführt Modifikationen an der Langendorff-Technik, um entsprechende linksventrikulären (LV) Vor-und Nachlast Druck 3 zu etablieren. Das Modell ist als die isolierte LV Arbeits-Herz-Modell bekannt und wurde ausgiebig auf Leistung und Stoffwechsel LV 6.4 Studie verwendet. Dieses Modell, jedoch nicht, eine richtig geladen rechte Ventrikel (RV). Demmy et al. ersten berichteten von einer biventrikulären Modell als eine Modifikation des LV Arbeiten Herzmodell 7, 8. Sie fanden, dass das Schlagvolumen, Herzzeitvolumen, und der Druck in der Entwicklung von Herz-Modus zu arbeiten LV biventrikulären Arbeitsmodus 8 konvertiert verbessert </sup>. Ein ordnungsgemäß geladen RV verringert sich ebenfalls abnorme Druckgradienten über dem Septum zu Septum-Funktion zu verbessern. Biventrikulären arbeiten Herzen hat sich gezeigt, Aorten-Ausgang, Lungen fließen, bedeuten Aortendruck, Herzfrequenz und myokardialen ATP-Spiegel für bis zu 3 Stunden 8 zu halten.

Bei der Untersuchung der metabolischen Wirkungen von myokardialer Verletzung, wie Ischämie, ist es oft notwendig, um die Position des betroffenen Gewebes zu ermitteln. Dies kann durch Abbilden erfolgen die Fluoreszenz von NADH (die reduzierte Form von Nikotinamidadenindinukleotid) 9-11, vor ein Coenzym in großen Mengen in den Mitochondrien. NADH-Fluoreszenz (fNADH) einen in der Nähe linear inverse Beziehung zu den lokalen Sauerstoffkonzentration 12 und liefert ein Maß für mitochondriale Redoxzustand 13. fNADH Bildgebung während hypoxischen ischämischen Zuständen und als Farbstoff-freies Verfahren verwendet worden, um hypoxischen Regionen 14, 15 zu identifizieren und um das Fortschreiten der Überwachunghypoxischen Bedingungen im Laufe der Zeit 10.

Das Ziel der Methode ist die mitochondriale Redoxzustand biventrikulären arbeiten Herzen während der Protokolle, die die Rate der Myozyten-Stoffwechsel verändern oder zu veranlassen Hypoxie oder erstellen Sie eine Kombination aus beiden zu überwachen. Herz aus weißen Neuseeland-Kaninchen wurden zu einem biventrikulären arbeiten Herzen System (Hugo Sachs Elektronik) angeschlossen und perfundiert mit modifiziertem Krebs-Henseleit-Lösung 16 bei 37 ° C Aorten-, LV, Lungenarterie, und links und rechts atriale Drücke aufgezeichnet wurden. Die elektrische Aktivität wurde unter Verwendung eines monophasischen Aktionspotentials Elektrode. Um das Bild zu fNADH wurde Licht von einer Quecksilberlampe gefiltert (350 ± 25 nm) und verwendet, um das Epikard zu beleuchten. Emittierte Licht wurde filtriert (460 ± 20 nm) und abgebildet werden mit Hilfe einer CCD-Kamera. Änderungen in der epikardialen fNADH der biventrikulären arbeiten Herzen bei verschiedenen Herzfrequenzen werden vorgestellt. Die Kombination des Herzens Modell und fNADH Bildgebungbietet ein neues und wertvolles experimentelles Werkzeug zur Untersuchung von akuten kardialen Pathologien im Zusammenhang mit realistischen physiologischen Bedingungen.

Protocol

1. Einrichten für das Studium Bereiten Sie vier Liter modifizierte Krebs-Henseleit-Lösung 16 (in mM: 118 NaCl, KCl 3,30, 2,00 CaCl 2, 1,20 MgSO 4, 24,0 NaHCO 3, 1,20 KH 2 PO 4, 10,0 Glukose, 2,00 NaPyruvate, und 20,0 mg / L Albumin ). Die Lösung sollte so kurz vor dem Beginn des Experiments wie möglich hergestellt werden. Der pH-Wert sollte auf 7,4 nach sterilen Filterung (: 22 pm, Corning Porengröße) eingestellt werden. Osmolalität der Lösung sollte zwischen 275 und 295 mosm / kg betragen. Spülen Sie alle Rohre und Kammern des Herzens arbeiten System mit gereinigtem Wasser. Führen Pumpen, bis alles Wasser aus dem System entfernt wurden. Fügen Zellulose Membranfilter (Porengröße: 5 um, Advantec) im Einklang mit jeder der Perfusion Pumpen (Langendorff-Perfusion Pumpe, linke Herz Perfusionspumpe und rechten Herzens Perfusionspumpe). Führen Sie eine Zweipunkt-Kalibrierung (0 und 60 mmHg) für jeden Drucksensor. Schalten Sie die Wasserbäder. Eine erhitzte zirkulierenden Wasserbad (Cole Palmer) wird verwendet, um die Wassermantel und Wärmeaustauscher erwärmt. Perfusat in einem separaten Wasserbad (Oakton Instruments) vorgewärmt. Beide Bäder sind so eingestellt, eine Lösung von 37 ° C zu halten Schalten der Pumpe an das Perfusat in einer geschlossenen Schleife zu zirkulieren. Perfusat durchläuft Mikrofaser Oxygenatoren (Hämofilter) mit 95% O 2 und 5% CO 2 bei 80 kPa vergast. Sauerstoffhaltige Perfusat strömt dann durch die Wärmetauscher, um es bei einer Temperatur von 37 ° C zu halten, bevor sie das Herz Kanülen. 2. Herz Exzision Beginnen Sie, indem Sie die Arbeit Herzen System in konstantem Druck Langendorff-Modus betrieben werden. Den Druck der Aorta Block innerhalb des Bereichs von 50 bis 60 mmHg. Anesthetize das Kaninchen mit einer intramuskulären Injektion von Ketamin (44 mg / kg) und Xylazin (10 mg / kg). Nachdem die Kaninchen ist sediert, Pentobarbital (50 mg / Kg) und Heparin (2000 U) intravenös in die marginale Ohrvene oder der lateralen Saphenusvene auf der Innenseite der hinteren Extremität injiziert. Wenn das Kaninchen vollständig nicht reagiert, wie durch das Fehlen der Schmerzreflexes bestimmt, die Brusthöhle schnell geöffnet wird, das Perikard geschnitten wird, wird die Aorta abgeklemmt und das Herz und die Lungen ausgeschnitten. An diesem Punkt sollte die Lungen an das Herz links angebracht werden, um mit Isolierung der Pulmonalvenen zu helfen. Isolieren und Kanülierung der Aorta mit einem Durchmesser von 5 mm Kanüle, die eine Spritze mit 60 ml Perfusat und 200 Einheiten Heparin gefüllt befestigt ist. Sichern Sie die Aorta an der Kanüle mit Größe Null Seidennaht und langsam drücken Sie die Spritze, um das Herz Blut zu spülen. 3. Biventrikulären Kanülierung Schließen Sie das Herz der Aorten-Block von der Arbeitsgruppe Herz-System. Verhindern Sie das Eindringen von Luft in die Aorta, die Koronar-Embolien verursachen können. Am besten ist es, die Kanüle auf die Aorten-BL legenock durch Annäherung an den Aorten-Anschluss in einem schiefen Winkel und ermöglicht Perfusat vorsichtig aus dem Verbinder tropft in die Kanüle während es befestigt ist. Während das Herz in konstantem Druck Langendorff-Modus perfundiert wird, entfernen Sie den Fett-und Bindegewebe und suchen Sie die folgende Schiffe: inferior und Vena cava superior, Vena azygos, Lungenarterien, Lungenvenen. Ligieren des oberen Hohlvene. Schneiden der Pulmonalarterie unterhalb wo es sich auf den rechten und linken Lungenarterien. Gruppe alle übrigen Schiffe (die Lungenvenen) zwischen Herz und Lunge und ligieren sie alle mit einer Naht. Entfernen Sie in die Lunge. Schneiden Sie ein kleines Loch in der Ecke des linken Herzohr. Stellen Sie sicher, dass die LA mit Perfusat gefüllt ist. Kanülierung des LA gleichzeitig sicherzustellen, dass die Kanüle vollständig mit Perfusat gefüllt, während sie eingeführt wird. Nähen Sie die Kanüle mit dem LA Anhängsel. Biegen Sie auf der linken Seite (Pumpe # 2) zum Fließen zu bieten ter linken Vorhof. Stellen Sie Vorspanndruck zwischen 2 bis 6 mmHg und passen ± 2 mmHg, wie von Vorhof-Dilatation bestimmt. Schalten Sie das Herz der Arbeiterklasse Herz-Modus durch Ausschalten des Langendorff (Pumpe # 1). Momentan verringert den Aortendruck bis 10 mmHg und dann langsam zu erhöhen, um innerhalb des Bereichs von 80 bis 100 mmHg. Auf diese Weise können die Aortenklappe zu öffnen und zu funktionieren, wie es während der normalen physiologischen Bedingungen. Die endgültige Nachlast Druck hängt von der Kontraktilität des LV ab. Es sollte auf einen Wert, der etwa 20 mmHg weniger als Höhepunkt LV Druck gesetzt werden. LV Herzleistung durch Messen der Strömungsgeschwindigkeit des Perfusat Verlassen des Aorten-Block (ml / min) bestimmt werden. Normalem Herzausgabevolumen zwischen 14.77 und 16,43 ml / min pro 100 g Körpergewicht 17 und Durchschnittswerte 340 ml / min für ein 2,2 kg Kaninchen. Aortendruck sollte das Drucksignal in 1 gezeigt aussehen. Kanülieren die RA durch die inferior Hohlvene. Stellen Sie sicher, dass sowohl die RA und die Kanüle vollständig mit Perfusat gefüllt und legen Sie die Kanüle unter Vermeidung der Bildung von Luftblasen. Nähen Sie die Kanüle in die Vene. Drehen auf der rechten Seite (die Pumpe Nr. 3) um die Strömung zu dem rechten Atrium. Stellen Sie den Druck auf ca. 3 mmHg. Sicherstellen, dass die RV mit Perfusat gefüllt ist und kanülieren die Lungenarterie. Stellen Sie sicher, dass die Kanüle vollständig mit Perfusat gefüllt, während es eingesetzt wird, um Luftblasen zu verhindern. Nähen Sie die Kanüle in die Lungenarterie. 4. Signalerfassung: Drücke, monophasische Aktionspotentiale und fNADH Sobald biventrikulären Kanülierung abgeschlossen ist, setzen Sie die Druckaufnehmer Katheter (Millar) in die Aorta über die Aorta Kanüle. Vorsichtig zu navigieren es über die Aortenklappe und in den LV. Überwachen des LV-Druck-Signal um die richtige Positionierung der Katheterspitze zu gewährleisten. Ein Beispiel für LV-Druck gezeigtin 1. Drücken Sie den monophasischen Aktionspotentials Elektrode gegen ventrikuläre Epikard. Überwachen Sie das Signal, geeignete Maßnahmen zu möglichen Messungen zu ermöglichen. Leichte Bewegungsartefakte im Signal ist normal. Legen Sie eine bipolare Reiz-Elektrode auf dem rechten Vorhof, um das Herz zu stimulieren. In unserem Protokoll, waren am Herzen Zykluslänge zwischen 300 und 150 ms, entsprechend 200 und 400 Schlägen pro Minute, jeweils Tempo. Messen der Temperatur des LV epikardialen Oberfläche. Wenn die Studie voraus, dass die Temperatur bei 37 ° C gehalten werden dann positionieren Sie das Herz in einem Wassermantel Herzkammer oder Tauchen Sie das Herz in einem gewärmten Superfusat Bad, eine konstante Temperatur während des gesamten Herzens zu erhalten. Positionieren Sie den CCD-Kamera (Andor Ixon DV860, 128×128 Pixel) und die Fokussierung des Objektivs, so dass eine entsprechende Sehfeld beobachtet wird. Die Kamera ist mit einer Arbeitsstation verbunden und Bilder werden mit 2 Bildern pro Sekunde aufgenommen mit Andor SOLIS softwawieder. Schalten der Quecksilberlampe Licht vor dem Beginn der Bildgebung. Licht wird durch ein Anregungsfilter (350 ± 25 nm, Chroma Technology) und in einen Lichtleiter (Horiba Jobin Yvon Modell 1950-1M) gerichtet, um die Oberfläche des Herzens zu beleuchten. Die Dämpfung von UV-Licht durch den Lichtleiter klein ist. UV-Beleuchtung könnte auch durch Verwendung einer Hochleistungs-LED-System, bestehend aus LED-Strahlern (Mightex PLS-0365-030-S) und eine Steuereinheit (Mightex SLC-SA04-US) werden. Schalten Sie das Licht und Raum so gering wie möglich Ambientebeleuchtung. Richten Sie die Beschläge der Lichtleiter (oder LED-Strahler) in den Mittelpunkt, um eine gleichmäßige Ausleuchtung zu erzielen epikardialen. Emissions-NADH-Fluoreszenz (fNADH) durch einen Emissionsfilter (460 ± 20 nm Chroma Technology) und wird von der CCD-Kamera abgebildet wird. Überwachen fNADH Veränderungen über die Zeit durch die eine Region von Interesse unter Verwendung des bildgebenden Software. Wählen Sie Live-Update-Modus, um den mittleren Pixel-Intensität innerhalb der Region o überwachenf Interesse. Das Herz sollte in biventrikulären Arbeitsmodus zu funktionieren, geeignete Drücke erzeugen. fNADH Ebenen sollte niedrig und stabil über der epikardialen Oberfläche, um eine angemessene Koronarperfusion bestätigen. An diesem Punkt in der Studie eine bestimmte experimentelle Protokoll zu treffen, um eine Hypothese zu testen. Wenn die Studie abgeschlossen ist, entfernen Sie das Herz aus dem System ablassen und alle Perfusat. Spülen Sie das System Schläuche und Kammern mit gereinigtem Wasser. Für die normale Pflege, sollte das System periodisch mit Mucasol Lösung oder einer verdünnten Wasserstoffperoxid-Lösung, je nach Bedarf zu spülen. 5. Offline-Verarbeitung von fNADH Images Eine Möglichkeit, NADH Datensätze zu vergleichen (fNADH (i, j, t)) zwischen den Experimenten ist, jedes Bild unter Verwendung eines Fluoreszenz-Referenzbild zu normalisieren (fNADH (i, j, t 0)) aus dem Datensatz 9, wie in der Gleichung unten gezeigt . Eine andere Möglichkeit, NADH Fluoreszenz normalisieren ist es, place ein kleines Stück Uranyl Glas in dem Sichtfeld vor dem Experiment 9, 18, ​​19. Uranyl Glas vor Fluoreszenz (450 – 550 nm) mit UV-Licht, um ein Signal, das als stabile Referenz verwendet werden kann beleuchtet. 6. Repräsentative Ergebnisse Front-und basalen Ansichten eines biventrikulären arbeiten Kaninchen Herzen Herstellung sind in Abbildung 1 dargestellt. Die linksventrikuläre Druck wurde durch Navigieren eines Druckwandler Katheter (Millar SPR-407) an der Aortenklappe und in die linke Herzkammer. Aorten, Pulmonalarterie und linksventrikulären Druck (LVP) sind in 1C gezeigt. Diastolischen LVP ist in der Regel zwischen 0 und 10 mmHg. Die minimale diastolische Aortendruck beträgt etwa 60 mmHg. Systolische LVP ist abhängig von Fülldruck (die Vorspannung oder LA-Druck) und Kontraktilitätund optimalerweise zwischen 80 und 100 mmHg beträgt. Die maximale Aortendruck und maximale LVP sollte eng übereinstimmen, wie in 1C gezeigt. Einphasige Aktionspotentialen (MAPs) mit einer schnellen Depolarisation und Repolarisation Phase, die typisch für Kaninchenherzen sind, werden in 1D gezeigt. MAPs können relativ leicht von einem öffentlichen Herzen aufgezeichnet, aber haben in der Regel kleine Bewegungsartefakte während der Diastole, wie in 1D gezeigt. MAPs sind nützlich für die Bestätigung erfolgreich Mitnahme des Herzens (capture) während der Stimulation und kann auch verwendet, um lokale elektrophysiologischen Veränderungen durch Ischämie oder anderen akuten Störungen zu messen. Ein EKG kann auch durch Eintauchen des Herzens in ein Bad von warmen Superfusat und Anordnen einer Elektrode in dem Bad auf der linken und rechten Seite des Herzens gemessen werden. Eine dritte indifferente Elektrode wird entweder in das Bad eingesetzt, vom Herzen oder an der Aorta.Ein EKG liefert Informationen über die globale Anregungs-und Repolarisation Prozess, der nützlich für die Bewertung des gesamten elektrischen Funktion und aufschlussreich für das Vorhandensein von Ischämie ist. fNADH Bildgebung zeigt Veränderungen in der mitochondrialen Redox Zustand des Herzens, die verwendet werden, um die Raumzeit-Progression von ischämischen oder hypoxischen Regionen gemessen werden kann. Für diese Studie wurde epikardialen fNADH gemessen, um Veränderungen der Redox-Status während drei Stimulationsfrequenzen bei Zykluslängen (CLs) von 300, 200 und 150 ms zu überwachen. Durchschnittliche fNADH Werte aus einer Region of Interest (roter Kasten, Abbildung 2) zeigen, dass die Grundlinie fNADH Ebenen als die Zykluslänge verkürzt wird steigen. Wenn Stimulationsfrequenz liegt in der Nähe des Sinusrhythmus (CL = 300 ms) Baseline fNADH Niveau relativ konstant ist. Als Zykluslänge wird unterhalb von 300 ms, Baseline fNADH Ebenen Anstieg, wobei der größte Anstieg bei der kürzesten CL (150 ms) verkürzt. Hochauflösende fNADH Bildgebung des gesamten vorderen Flächebei 200 und 400 Schlägen pro Minute wird in Abbildung 3 dargestellt. fNADH Ebenen bei 200 bpm waren konstant und räumlich homogen. Bei 400 bpm, erhöht fNADH Ebenen im Wesentlichen durch das Epikard. Deutliche räumliche Heterogenität wurde mit den höchsten Zuwächsen, die innerhalb der septalen Regionen des RV und LV beobachtet. Die fNADH Signal oszilliert mit Kontraktion (Bewegungsartefakte) und die Frequenz der Schwingung entspricht Herzfrequenz (Abbildung 2). In biventrikulären Kanülierung, wird die Basis des Herzens durch 4 Kanülen, die um das Herz an einem Schwingen während der Kontraktion zu verhindern hilft, gehalten. Daher ist Schwingungsamplitude immer weniger als jeder längeren Zeitskala (5-10 sec) Trends in fNADH, die durch Ischämie oder Hypoxie verursacht werden. Abbildung 1. Typische Drücke und monophasischen Aktionspotentialen von einer isolierten biventrikulären arbeiten raBBIT Herzen. A. Basal Ansicht des Herzens, in die vier Kanülen: 1, Aorten, 2, Lungenarterie, 3, linke atriale und 4, das rechte atriale B. Vorderansicht des Herzens, in den linken Ventrikel (LV) und den rechten Ventrikel. (RV). C Repräsentative Druck. Top: linksventrikuläre Druck (durchgezogene Linie) und der Aortendruck (gepunktete Linie). Unten:. Pulmonalen Druck D. Repräsentative monophasischen Aktionspotentialen. Das Signal wird mit dem Druck in Panel C gezeigt ausgerichtet Klicken Sie hier für eine größere Abbildung anzuzeigen . Abbildung 2. fNADH Abbildung eines isolierten biventrikulären arbeiten Kaninchen Herzen. Oben: Eine Karikatur des Sichtfeldes (links) und drei fNADH Bilder angezeigt werden. Die entsprechende Pacing-Zyklus Länge (CL) für jedes Bild angezeigt.Die Region von Interesse für die fNADH Signal im unteren Bereich wird durch die rote Box gekennzeichnet. Die Spitze des monophasischen Aktionspotentials Elektrode auf der rechten Seite der Region von Interesse zu sehen. Das Epikard wurde beleuchtet mit dem Quecksilber-Lampe und Lichtleiter, wie in Abbildung 5 dargestellt. Nur der epikardialen Oberfläche rund um die Region von Interesse wurde beleuchtet. Unten: Durchschnittliche fNADH für die Region von Interesse angezeigt durch die rote Box in der oberen Abdeckung. Durchschnittliche fNADH steigt mit reduzierter Zykluslänge. Abbildung 3. fNADH Bilder des vollen vorderen Oberfläche eines isolierten biventrikulären arbeiten Kaninchen Herzen. Das Herz war Tempo aus der RA bei 200 bpm und 400 bpm. fNADH abgebildet wurde (2 fps, 128×128 Pixel bei einer Auflösung von 0,4 mm), während die Beleuchtung des gesamten vorderen Epikard mit zwei Hochleistungs-LEDs (Mightex PLS-0365-030-S, 365 nm, 4% intensity, 50 mW max).

Discussion

Die isolierte Langendorff perfundierte Herz bleibt ein prominentes Werkzeug zur Untersuchung der kardialen Physiologie 2. Es ist besonders nützlich in Studien von Herzrhythmusstörungen, insbesondere solchen, die Fluoreszenz-Bildgebung der Transmembranpotential 20 zu verwenden. Ein Vorteil ist, dass die gesamte Epikard des isolierten Herzen 21, 22 beobachtet werden kann. Ein weiterer Vorteil ist, dass, im Gegensatz zu Blut, Perfusion mit einer klaren kristalloiden Pufferlösung nicht mit Fluoreszenz-Signale stören. Eine Einschränkung ist, dass die Langendorff-Technik nicht für die Untersuchung der kardialen Metabolismus, die oft das Herz, die Arbeit im Rahmen der physiologischen und Nachlast Druck durchzuführen gut geeignet.

Um die Relevanz von isolierten Herzen Vorbereitungen für metabolische Studien, Neely eingeführt Modifikationen an der Langendorff-Technik, um entsprechende linksventrikulären (LV) Vor-und Nachlast Druck 3 etablieren zu erheben.Das Modell ist als die isolierte LV Arbeits-Herz-Modell bekannt und wurde ausgiebig auf Leistung und Stoffwechsel LV 6.4 Studie verwendet. Der LV Arbeits Herz-Modell ist besser als die Langendorff Modell für funktionelle Auswertungen, aber es bietet keine ordnungsgemäß geladen rechten Herzkammer (RV). Demmy et al. ersten berichteten von einer biventrikulären Modell (LV & RV) als Modifikation des LV Arbeiten Herzmodell 7, 8. Sie fanden, dass das Schlagvolumen, Herzzeitvolumen, und der Druck in der Entwicklung von Herz-Modus zu arbeiten LV biventrikulären Arbeitsmodus 8 konvertiert verbessert. Ein ordnungsgemäß geladen RV verbessert auch die septalen Funktion durch Verminderung abnormalen Druckgradienten über der Scheidewand. Biventrikulären arbeiten Herzen hat sich gezeigt, Aorten-Ausgang, Lungen fließen, bedeuten Aortendruck, bedeuten pulmonalen Blutdruck, Herzfrequenz und myokardialen ATP und Kreatinphosphat Ebenen für bis zu 3 Stunden 8 zu halten. Biventrikulären arbeiten Herzen Studien verwenden in der Regel Herzen from kleine Tiere wie Ratten und Kaninchen, weil die Herzleistung und das erforderliche Volumen des Perfusat viel geringer als für Herzen von größeren Tieren sind. Allerdings haben biventrikulären arbeiten Herzen Studien durchgeführt, mit Herzen von Schweinen, Hunden und sogar Menschen 23, 24.

Die metabolischen Bedarf von isolierten Herzen in biventrikulären Arbeitsmodus ist wesentlich höher als die der Langendorff-Perfusion. Es ist wichtig, dass das Perfusat Lösung genug Sauerstoff und metabolischen Substrat biventrikulären Herzfunktion zu unterstützen. Standard-kristalloiden Pufferlösungen, wie Krebs-Henseleit-16, 17, 25 oder Tyrodes 26, 27 haben Sauerstofflöslichkeiten so hoch wie 5,6 mg / L. Wenn diese Lösungen mit Carbogen (ein Gas Mischung aus 95% O 2 und 5% CO 2) werden vergast und enthalten geeignete metabolischen Substrat (Glucose, Dextrose, und / oder Natriumpyruvat), sind sie geeignet für biventrikulären arbeiten Herzen schlagen in Normal Sinus Preise (ca. 180 bpm für ein Kaninchen).

Metabolische steigender Nachfrage für schnelle Rhythmen und die Menge an Sauerstoff in Standard Perfusaten gelöst möglicherweise nicht genug, um vollständige Unterstützung für eine biventrikuläre arbeiten Herz, das bei hohen schrumpft. Kristalloiden Pufferlösungen mit Erythrozyten oder gemischt mit Vollblut haben in der Arbeit Herzen Präparate verwendet worden, um ausreichend Sauerstoff Verfügbarkeit zu gewährleisten. Frühere Studien haben gezeigt, dass das Hinzufügen Erythrozyten zu einer Krebs-Henseleit-Lösung der Verbesserung der Arbeitsbedingungen Herzfunktion während strenge Stimulation Protokolle und auch die Häufigkeit von Kammerflimmern 16. Eine Einschränkung der Verwendung von Erythrozyten oder Mischungen aus Vollblut ist, dass Hämoglobin wird Lichtwellenlängen, die für die Fluoreszenz-Bildgebung 13 verwendet werden. Andere Substrate, wie Albumin, kann auch gegeben, um Lösungen zu Herzen Perfusat Lebensfähigkeit zu verlängern und die Ödeme 28 steht.

Während der Fluoreszenz-Bildgebung die Intensität des Anregungslichts hoch sein sollte und die Lichtverteilung sollten einheitlich sein. Eine gleichmäßige Beleuchtung ist nicht immer einfach aufgrund der Krümmung der epikardialen Oberfläche. In unseren Studien haben wir Bild fNADH durch Filterung Licht (350 ± 25 nm) von einer Quecksilberlampe. Verzweigter Lichtleiter wird verwendet, um die UV-Licht auf der epikardialen Oberfläche zu leiten. Einheitliche Beleuchtung kann durch entsprechende Positionierung der beiden Ausgangs Aderendhülsen erreicht werden. UV-LED-Lichtquellen ebenfalls verwendet werden, wie wir in 3 gezeigt haben. LED-Quellen sind relativ billig, so dass mehrere Quellen könnten in ein bildgebendes System aufzunehmen. LEDs können auch geradelt werden ein-und ausschalten mit hohen Raten an Anregungslicht mit der Bildaufnahme synchronisiert werden.

Photobleichen von NADH sollte 29 durch Reduzierung der Zeit von Gewebe Beleuchtung minimiert werden. Dies kann durch Radfahren die Beleuchtung ein-und ausschalten mit einem Elektronenmikroskop durchgeführt werdenIC-Shutter und eine Lampe oder mit einer LED-Beleuchtungssystem und einem Controller. Falls die Beleuchtung mit dem Herzzyklus synchronisiert ist, dann fNADH Bildaufnahme kann der Diastole beschränkt werden, was Bewegungsartefakt in der Fluoreszenz-Signale zu reduzieren. Ausschaltpunkt Beleuchtung und die Bildaufnahme unter Verwendung eines Drucksignals, wie LV-Druck, wäre eine Möglichkeit, dies zu tun.

In unseren Studien haben wir festgestellt, dass Veränderungen in fNADH pro Zeiteinheit mehr sein kann als 5X höher bei 400 bpm als bei 200 bpm. Dies deutet darauf hin, dass schnelle Rhythmen der Redox-Zustand des Herzens zu erhöhen. Ob dies durch Hypoxie oder die Unfähigkeit von Myozyten, NADH zu NAD zu oxidieren verursacht + schnell genug, um die Akkumulation von NADH zu vermeiden, ist noch nicht geklärt.

Die Leistung eines biventrikulären Herz arbeitet Vorbereitung ist abhängig von mehreren Faktoren ab. Eine der wichtigsten besteht darin, geeignete Vor-und Nachlast Druck gesetzt, um die physiologische nachahmenBedingungen, die der Untersuchung sind. Insbesondere müssen die LV-Nachlast (Aortendruck) eingestellt werden, um systemische Druck vertreten werden. Wenn sie zu hoch ist, wird die LV nicht in der Lage, den Druck zu überwinden, was zu Aufstoßen. Der Druck, der zu niedrig ist, wirken sich nachteilig auf Koronarperfusion. Der LV Vorspanndruck (linken atrialen Druck) ebenfalls eingestellt, um eine enddiastolischen Volumen, die für das experimentelle Protokoll bereitzustellen.

fNADH Abbildung von lebenden Gewebes ist eine etablierte Art der Fluoreszenz-Imaging-13. Seine Anwendung auf Herzgewebe wurde von Barlow und Chance dargestellt, wenn sie von markanten Erhebungen fNADH innerhalb regional ischämischen Gewebe nach Ligatur eines Herzkranzgefäßes 14 berichtet. Ihre Bilder wurden auf fNADH Film mit einem Oszilloskop Fairchild Kamera-und UV-Blitzfotografie aufgezeichnet. Coremans et al. erweitert auf diesem Konzept mit der NADH Fluoreszenz / UV-Reflexion Verhältnis zu Messe der metabolischen Zustand des Epikard von Langendorff Blut-perfundierten Rattenherzen 30. Ein videofluorimeter wurde für die Bildgebung verwendet und Daten wurde mit einem Videorecorder. Später, Scholz et al. verwendet einen Spektrographen und der Photodiode Array durchschnittliche fNADH aus einem großen Bereich des LV zu messen. Dieser Ansatz reduziert die Auswirkungen der epikardialen Fluoreszenz Heterogenitäten und lokale Varianten im Umlauf, während enthüllen makroskopischen arbeitsbedingte Variationen fNADH 31. Dieser Ansatz ist ähnlich Computing durchschnittliche fNADH Ebenen für eine Region von Interesse in allen Frames eines fNADH Bilddatenstatz, wie in 2 dargestellt. Wie wir in diesem Artikel vorgestellt haben, bietet die heutige Technologie High-Speed-CCD-Kameras und digital gesteuerte Hochleistungs-UV-Strahlern. Diese Technologien ermöglichen die räumlich-zeitliche Dynamik der fNADH und Herz-Stoffwechsel in den Genuss vieler neuer Perspektiven untersucht werden. Die relativ geringe Kosten bei der die Optik und die Lichtquelle ist fNADH Bildgebung ein nützliches Zubehör für die konventionelle Herz-optische Mapping-Systeme. 9, 32

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Diese Arbeit wurde durch ein Stipendium der NIH (R01-HL095828 zu Kay MW) unterstützt.

Materials

Chemical Company Catalogue Number
NaCl Sigma-Aldrich, St. Louis, MO S-3014
KCl Sigma-Aldrich, St. Louis, MO P3911-500G
CaCl2 Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ C77-500
MgSO4 Sigma-Aldrich, St. Louis, MO M-7506
NaHCO3 Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ S-233
KH2PO4 Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ 423-316
Glucose Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 158968-500G
NaPyruvate Sigma-Aldrich, St. Louis, MO P2256-25G
Albumin Sigma-Aldrich, St. Louis, MO A9418-100G
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Langendorff, O. Untersuchungen am uberlebenden saugethierherzen [investigations on the surviving mammalian heart]. Arch. Gesante Physiol. 61, 291-332 .
  2. Skrzypiec-Spring, M., Grotthus, B., Szelag, A., Schulz, R. Isolated heart perfusion according to langendorff—still viable in the new millennium. J. Pharmacol. Toxicol. Methods. 55, 113-126 (2007).
  3. Neely, J. R., Liebermeister, H., Battersby, E. J., Morgan, H. E. Effect of pressure development on oxygen consumption by isolated rat heart. Am. J. Physiol. 212, 804-814 (1967).
  4. Feng, H. Z., Jin, J. P. Coexistence of cardiac troponin T variants reduces heart efficiency. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 299, H97-H105 (2010).
  5. Clemens, M. G., Forrester, T. Appearance of adenosine triphosphate in the coronary sinus effluent from isolated working rat heart in response to hypoxia. J. Physiol. 312, 143-158 (1981).
  6. Cole, M. A., Murray, A. J., Cochlin, L. E., Heather, L. C., McAleese, S., Knight, N. S., Sutton, E., Jamil, A. A., Parassol, N., Clarke, K. A high fat diet increases mitochondrial fatty acid oxidation and uncoupling to decrease efficiency in rat heart. Basic Res. Basic Res. Cardiol. 106, 447-457 (2011).
  7. Demmy, T. L., Curtis, J. J., Kao, R., Schmaltz, R. A., Walls, J. T. Load-insensitive measurements from an isolated perfused biventricular working rat heart. J. Biomed. Sci. 4, 111-119 (1997).
  8. Demmy, T. L., Magovern, G. J., Kao, R. L. Isolated biventricular working rat heart preparation. Ann. Thorac. Surg. 54, 915-920 (1992).
  9. Kay, M., Swift, L., Martell, B., Arutunyan, A., Sarvazyan, N. Locations of ectopic beats coincide with spatial gradients of NADH in a regional model of low-flow reperfusion. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 294, 2400-2405 (2008).
  10. Swift, L., Martell, B., Khatri, V., Arutunyan, A., Sarvazyan, N., Kay, M. Controlled regional hypoperfusion in langendorff heart preparations. Physiol. Meas. 29, 269-279 (2008).
  11. Kay, M. W., Swift, L. M., Sangave, A., Zderic, V. High resolution contrast ultrasound and NADH fluorescence imaging of myocardial perfusion in excised rat hearts. , 1-4 (2008).
  12. Chance, B. Pyridine nucleotide as an indicator of the oxygen requirements for energy-linked functions of mitochondria. Circ. Res. 38, I31-I38 (1976).
  13. Mayevsky, A., Rogatsky, G. G. Mitochondrial function in vivo evaluated by NADH fluorescence: From animal models to human studies. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 292, C615-C640 (2007).
  14. Barlow, C. H., Chance, B. Ischemic areas in perfused rat hearts: Measurement by NADH fluorescence photography. Science. 193, 909-910 (1976).
  15. Mayevsky, A., Chance, B. Oxidation-reduction states of NADH in vivo: From animals to clinical use. Mitochondrion. 7, 330-339 (2007).
  16. Gillis, A. M., Kulisz, E., Mathison, H. J. Cardiac electrophysiological variables in blood-perfused and buffer-perfused, isolated, working rabbit heart. Am. J. Physiol. 271, H784-H789 (1996).
  17. Ôta, K., Peaker, M. Lactation in the rabbit: Mammary blood flow and cardiac output. Experimental Physiology. 64, 225-238 (1979).
  18. Ashruf, J. F., Ince, C., Bruining, H. A. Regional ischemia in hypertrophic langendorff-perfused rat hearts. Am. J. Physiol. 277, H1532-H1539 (1999).
  19. Ashruf, J. F., Coremans, J. M., Bruining, H. A., Ince, C. Increase of cardiac work is associated with decrease of mitochondrial NADH. Am. J. Physiol. 269, 856-862 (1995).
  20. Efimov, I. R., Nikolski, V. P., Salama, G. Optical imaging of the heart. Circ. Res. 95, 21-33 (2004).
  21. Rogers, J. M., Walcott, G. P., Gladden, J. D., Melnick, S. B., Kay, M. W. Panoramic optical mapping reveals continuous epicardial reentry during ventricular fibrillation in the isolated swine heart. Biophys. J. 92, 1090-1095 (2007).
  22. Qu, F., Ripplinger, C. M., Nikolski, V. P., Grimm, C., Efimov, I. R. Three-dimensional panoramic imaging of cardiac arrhythmias in rabbit heart. J. Biomed. Opt. 12, 044019 (2007).
  23. Chinchoy, E., Soule, C. L., Houlton, A. J., Gallagher, W. J., Hjelle, M. A., Laske, T. G., Morissette, J., Iaizzo, P. A. Isolated four-chamber working swine heart model. Ann. Thorac. Surg. 70, 1607-1614 (2000).
  24. Hill, A. J., Laske, T. G., Coles, J. A., Sigg, D. C., Skadsberg, N. D., Vincent, S. A., Soule, C. L., Gallagher, W. J., Iaizzo, P. A. In vitro studies of human hearts. Ann. Thorac. Surg. 79, 168-177 (2005).
  25. Schenkman, K. A. Cardiac performance as a function of intracellular oxygen tension in buffer-perfused hearts. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 281, H2463-H2472 (2001).
  26. Pijl, A. J., Pfaffendorf, M., Mathy, M., Van Zwieten, P. A. Cardioprotection by nifedipine in isolated working hearts: A comparative study on three different types of experimental ischemia. J. Cardiovasc. Pharmacol. 21, 70-76 (1993).
  27. Khatib, S. Y., Boyett, M. R. Effects of glyburide (glibenclamide) on myocardial function in langendorff perfused rabbit heart and on myocardial contractility and slow calcium current in guinea-pig single myocytes. Mol. Cell Biochem. 242, 81-87 (2003).
  28. Kates, R. E., Yee, Y. G., Hill, I. Effect of albumin on the electrophysiologic stability of isolated perfused rabbit hearts. J. Cardiovasc. Pharmacol. 13, 168-172 (1989).
  29. Combs, C. A., Balaban, R. S. Direct imaging of dehydrogenase activity within living cells using enzyme-dependent fluorescence recovery after photobleaching (ED-FRAP). Biophys. J. 80, 2018-2028 (2001).
  30. Coremans, J. M., Ince, C., Bruining, H. A., Puppels, G. J. (Semi-)quantitative analysis of reduced nicotinamide adenine dinucleotide fluorescence images of blood-perfused rat heart. Biophys J. 72, 1849-1860 (1997).
  31. Scholz, T. D., Laughlin, M. R., Balaban, R. S., Kupriyanov, V. V., Heineman, F. W. Effect of substrate on mitochondrial NADH, cytosolic redox state, and phosphorylated compounds in isolated hearts. Am. J. Physiol. 268, 82-91 (1995).
  32. Holcomb, M. R., Woods, M. C., Uzelac, I., Wikswo, J. P., Gilligan, J. M., Sidorov, V. Y. The potential of dual camera systems for multimodal imaging of cardiac electrophysiology and metabolism. Exp. Biol. Med. (Maywood). 234, 1355-1373 (2009).

Tags

NADH Fluorescence ImagingIsolated Perfused HeartLangendorff TechniqueCardiac PhysiologyCardiac MetabolismLV Working Heart ModelBiventricular ModelStroke VolumeCardiac OutputPressure DevelopmentMyocardial InjuryIschemiaNADH Fluorescence

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Asfour, H., Wengrowski, A. M., Jaimes III, R., Swift, L. M., Kay, M. W. NADH Fluorescence Imaging of Isolated Biventricular Working Rabbit Hearts. J. Vis. Exp. (65), e4115, doi:10.3791/4115 (2012).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image