Produção de lentivirais para Células Transdução do Sistema Nervoso Central
Summary
Neste protocolo descrevemos produção, purificação e titulação de lentivirais. Nós fornecemos um exemplo de entrega do gene lentiviral vetor mediada em primárias neurônios cultivados e astrócitos. Nossos métodos podem também se aplicam a outros tipos de células<em> In vitro</em> E<em> In vivo</em>.
Abstract
De entrega de genes eficiente no sistema nervoso central (SNC) é importante no estudo funções de genes, modelando doenças neurológicas e desenvolvimento de abordagens terapêuticas. Lentivirais são ferramentas atraentes na transdução de neurónios e outros tipos de células no SNC como eles transdução ambas as células em divisão e não-dividindo, a expressão de transgenes apoio sustentado, e têm uma capacidade relativamente grande de embalagem e baixa toxicidade 1-3. Lentivirais têm sido usados com sucesso na transdução muitos tipos de células neurais in vitro e em animais 4-6 7-10.
Grandes esforços têm sido feitos para desenvolver lentivirais com segurança biológica melhorada e eficiência para entrega de genes. As correntes de terceira geração replicação defeituosa e auto-inativadora (SIN) lentivirais estão representados na Figura 1. Os elementos necessários para embalagem vetor são divididos em quatro plasmídeos. No trans lentiviralfer plasmídeo, a região U3 na repetição do 5 'terminal longa (LTR) é substituído com um promotor forte de outro vírus. Esta modificação permite a transcrição da sequência de vector independente do HIV-1 da proteína Tat que é normalmente necessária para a expressão do gene HIV 11. O sinal de empacotamento (Ψ) é essencial para a encapsidação e do elemento de Rev-responsivo (RRE) é necessária para a produção de vectores de título elevado. A central polypurine trato (CPPT) é importante para a importação nuclear do ADN do vector, uma característica necessária para transduzir células não-divisórias 12. No LTR 3 ', as sequências de cis-reguladoras são completamente removidos a partir da região U3. Esta supressão é copiado para LTR 5 'após a transcrição reversa, resultando em inactivação transcricional de ambos os LTRs. PMDLg plasmídeo / pRRE contém HIV-1 gag / pol genes, que fornecem as proteínas estruturais e transcriptase reversa. pRSV-Rev codifica rev, que se liga ao RRE para exportação de ARN eficiente a partir do núcleo. pCMV-G codificaa glicoproteína do vírus da estomatite vesicular (VSV-G), que substitui o HIV-1 env. VSV-G expande o tropismo dos vectores e permite a concentração por meio de ultracentrifugação 13. Todos os genes que codificam as proteínas acessórias, incluindo vif, vpr, Vpu, e Nef são excluídos no sistema de embalagem. A produção e manipulação de lentivirais deve ser realizada de acordo com as orientações do NIH para pesquisa envolvendo DNA recombinante ( http://oba.od.nih.gov/oba/rac/Guidelines/NIH_Guidelines.pdf ). Uma aprovação do Comitê de Segurança Institucional indivíduo Biológica e Química pode ser necessária antes de usar lentivirais. Lentivirais são geralmente produzidas por co-transfecção de células 293T com transferência lentiviral plasmídeo e os plasmídeos auxiliares que codificam as proteínas necessárias para a embalagem vector. Muitos plasmídeos de transferência lentivirais e plasmídeos auxiliares pode ser obtido a partir de Addgene, um nãoFins lucrativos repositório plasmídeo ( http://www.addgene.org/~~V ). Algumas linhas celulares estáveis de embalagem têm sido desenvolvidos, mas esses sistemas proporcionam menos flexibilidade e sua eficiência de embalagem geralmente decresce ao longo do tempo 14, 15. Os kits de transfecção comercialmente disponíveis podem suportar uma elevada eficiência de transfecção 16, mas podem ser muito caro para preparações de vector de grande escala. Métodos de cálcio precipitação de fosfato de fornecer transfecção altamente eficiente de células 293T e, assim, proporcionar uma abordagem confiável e de custo eficaz para a produção de vetor lentiviral.
Neste protocolo, que produzem lentivirais por cotransfecção de células 293T com quatro plasmídeos baseados no princípio precipitação com fosfato de cálcio, seguido de purificação e concentração com ultracentrifugação através de uma almofada de sacarose a 20%. Os títulos de vector são determinados por fluorescência-activated separação de células (FACS) analYsis ou por qPCR tempo real. A produção e titulação de lentivirais neste protocolo pode ser terminado com 9 dias. Nós fornecemos um exemplo de transdução esses vetores em murinos culturas neocorticais que contenham ambos os astrócitos e neurônios. Nós demonstramos que lentivirais suporte de elevada eficiência de transdução e expressão génica em células de tipo específico de células primárias de cultura a partir de CNS.
Protocol
Discussion
Neste protocolo, nós mostramos a produção de lentivirais e aplicação destes vectores em culturas neocorticais. Nós demonstramos eficiente e de células de transdução de tipo específico com os vectores produzidos por estes métodos. Quando o promotor sinapsina é usado, a expressão da GFP é estritamente neurónio específico. Quando o promotor GFAP é usado, expressão da GFP é exclusivamente em astrócitos. Se nenhuma célula expressão de tipo específico é requerido, um promotor ubíqua pode ser usado. En…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi financiado pelo NIH Neuroscience Blueprint Núcleo de subvenção (P30 NS057105, BJS) para Washington University, programa, projeto Grant NS032636 (BJS) e pelo Centro de esperança para distúrbios neurológicos.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| DMEM | Sigma-Aldrich | D5796 |
| MEM | Invitrogen | 11090-081 |
| Fetal bovine serum | Hyclone | SV3001403 |
| PBS | Mediatech | 21-040-CM |
| Trypsin-EDTA | Sigma-Aldrich | T3924 |
| Sodium butyrate | Sigma-Aldrich | B5887 |
| Hexadimethrine bromide (Polybrene) | Sigma-Aldrich | H9268 |
| 293T cells | ATCC | CRL-11268 |
| HT1080 cells | ATCC | CCL-121 |
| Falcon 100 x 20 mm tissue culture dish | BD Biosciences | 353003 |
| 1 x 3 ½ in polyallomoer centrifuge tube | Beckman-Coulter | 326823 |
| 0.2-micron syringe filter | Corning | 431219 |
| QIAamp DNA Mini Kit | Qiagen | 51304 |
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