الكروماتين تحليل التفاعل عن طريق ترتيب العلامات المقترنة النهائي (شيا-PET) هو وسيلة ل<em> من جديد</em> الكشف عن التفاعلات لونين، لفهم أفضل للتحكم النسخي.
ويتم تنظيم الجينوم في هياكل ثلاثية الأبعاد، واعتماد العليا التشكل داخل المساحات ميكرون الحجم النووية 7، 2، 12. أبنية هذه ليست عشوائية وتنطوي على التفاعل بين الجينات والمروجين العناصر التنظيمية 13. الربط من عوامل النسخ متواليات التنظيمية ليجلب محددة شبكة من تنظيم النسخ والتنسيق 1، 14.
وقد وضعت لونين تحليل التفاعل عن طريق ترتيب العلامات المقترنة النهائي (شيا-PET) لتحديد هذه الهياكل العليا لونين 5،6. يتم إصلاح الخلايا ويتم التقاطها بواسطة التفاعل المكاني التساهمية DNA البروتين الروابط المتبادلة. للحد من الضوضاء غير محددة والحد من التعقيد، وكذلك لزيادة خصوصية تحليل التفاعل لونين، لونين مناعي يستخدم (رقاقة) ضد العوامل المحددة لتخصيب البروتين شظايا لونين من الفائدة قبل ربط القرب. ربط تنطوي نصف linkers تشكل في وقت لاحق الروابط التساهمية بين أزواج من شظايا الحمض النووي المربوطة معا ضمن مجمعات لونين الفردية. تقييد انزيم مواقع MmeI المرافقة في linkers نصف تسمح استخراج المقترنة يبني مجتمع طلال أبوغزاله للرابط، علامة النهاية (الحيوانات الأليفة) على الهضم MmeI. كما هي المعقدة البيروكسيديز وlinkers نصف، وتنقية هذه التركيبات PET باستخدام streptavidin المغناطيسي الخرز. وligated الحيوانات الأليفة تنقيته مع محولات الجيل القادم التسلسل وفهرس للشظايا التفاعل يتم إنشاؤها عن طريق الجيل المقبل من التعاقب مثل الجينوم محلل البورشيد. ثم يتم تنفيذ رسم الخرائط وتحليل المعلومات البيولوجية للتعرف على رقاقة التخصيب ملزمة المواقع ورقاقة التخصيب التفاعلات ونين 8.
لدينا انتاج شريط فيديو لإثبات الجوانب الحاسمة للبروتوكول شيا-PET، وخاصة إعداد شريحة ونوعية المعالج تلعب دورا رئيسيا في نتائج مكتبة شيا-PET. كما البروتوكولات هيطويلة جدا، وتظهر فقط الخطوات الحاسمة في الفيديو.
شيا-PET هو طريقة تم تطويرها لتحديد التفاعلات طويلة المدى في تنظيم النسخ. واحدة من العوامل الحاسمة التي تحدد نوعية مكتبة شيا-PET هي نوعية المواد رقاقة.
البروتوكول هو موضح في الفيديو يتضمن استخدام السلع والخدمات البيئية والفورمالديهايد لعبور الارتباط الخلايا. فإن استخدام الفورمالدهايد جنبا إلى جنب مع كاشف عبر ربط 2 تحمل الذراع يعد التبادل تساعد في الربط من البروتينات التي لا يمكن أن تكون ملزمة الفورمالديهايد وحدها 3،11،15. لقد وضعنا المكتبات مع هذه الطريقة التي أثبتت مواقع الربط قوية وطويلة المدى التفاعلات 9. ومع ذلك، قد عبر ربط وينبغي أن يكون الأمثل ظروف رقاقة لكل عامل في المصالح، وأنه من المهم عدم الإفراط تشعبي كما الكثير عبر ربط سيؤدي إلى صعوبات في تجزئة من قبل صوتنة، ويؤدي ربما في التفاعلات ونين زائفة . لونين التفاعلاتوينبغي التحقق من صحة التي حددتها شيا-PET بطريقة مختلفة، مثل التهجين في الموقع مضان 4.
نوصي ما لا يقل عن 100 نانوغرام من المواد لونين. ولئن كنا قد شيدت المكتبات نوعية جيدة من 50 نانوغرام من المواد لونين، لاحظنا أن كميات كبيرة من المواد بدءا يسمح بناء شيا-PET المكتبات مع دورات PCR أقل من 16، وبالتالي تقليل amplicons والتكرار من كل مكتبة. هذا أقل التكرار يرتبط به أعلى فريدة من نوعها، وكذلك تعيين نسبة عالية من البيانات القابلة للاستخدام، وبالتالي تمكين تفاعل أكثر شمولا لونين مع عدد أقل من الخريطة حارات التسلسل. ينبغي أن الحجم النهائي معبأة من الخرز في كل أنبوب يكون 50 ميكرولتر ميكرولتر 100 لوالخرز المغناطيسي وsepharose و على التوالي. وإذا كان حجم حبة معبأة هو أقل من المعلن، وتحقيق الحد الأدنى لحجم محملة مسبقا وبالمثل مسح فارغة الخرز المغناطيسي أو sepharose و لتقليل الخسائر في DNA الحاملة للحبةق في الخطوات اللاحقة. وينبغي أن تستخدم لمرة واعادوا نصائح او نصائح واسعة الأساسية لpipetting الخرز sepharose و.
وقد أدرجت التعديلات التالية بعد بروتوكول شيا-PET المنشورة سابقا 5. أولا، تم استخدام الخرز المغناطيسي G لتقليل الخسائر خلال عينة يغسل. وبالإضافة إلى ذلك، حددنا نطاقات غير محددة مع أحجام تقريبية من 100 شركة بريتيش بتروليوم BP و138 إلى تكون amplicons الذاتي ligated linkers نصف أو / والمحولات. وبالتالي، خفضنا تركيز المعقدة البيروكسيديز linkers نصف و 454 محولات GS20 للحد من نطاقات غير محددة خلال التضخيم PCR. تم تخفيض حجم ربط القرب من 50 مل إلى 10 مل لتقليل الخسائر خلال عينة الخطوات اللاحقة تنقية وحفظ أيضا على تكاليف كاشف. ونحن أيضا زيادة فترة حضانة لشل شيا-PET DNA لالتقاط حبات لضمان القصوى لشيا-PET DNA على الخرز streptavidin.
خلال ربط القرب الخطوة، عمليات ربط خيالية ثار لا تمثل الحقيقية في التفاعلات المجراة لونين يتم إنشاؤها حتما بطريقة غير محددة وبشكل عشوائي. وبالتالي، لتقييم جودة البيانات من أي تجربة شيا-PET، ويقدر معدل الخيمرية من استخدام اثنين من مختلف linkers نصف مع محددة TAAG الباركود النوكليوتيدات وATGT 5. بعد التسلسل الإنتاجية العالية، ويتم تحليل متواليات شيا لأول مرة-PET لتكوين رابط الباركود وتسلسل مشتقة من منتجات محددة ومنتجات ربط ربط غير محددة يمكن تمييزها 8. النسبة المئوية للتعرف الوهم (أي heterodimers linkers AB) الموجودة في منزلنا في MCF-7 RNA البلمرة II-PET المكتبات شيا هو أقل من 15٪.
وتصنف فيما بعد شيا-PET متواليات إلى فئتين، هما الذاتي ربط الحيوانات الأليفة والحيوانات الأليفة ربط بين. ويتم الحصول على الحيوانات الأليفة ربط الذاتي من التعميم ربط الذاتي من لونين شظايا في حين يتم اشتقاق ربط بين الحيوانات الأليفة من أناnter-ربط بين اثنين من شظايا الحمض النووي مختلفة. هذا الأخير هو ثم تقسيمها إلى ثلاث فئات مختلفة استنادا إلى المسافة الجينية من كل علامة على نفس الصبغي (داخل الصبغي ربط بين الحيوانات الأليفة) أو التي يتم تعيينها إلى كل من به صبغيين مختلفة (interchromosomal ربط بين الحيوانات الأليفة). قمنا بتطوير برنامج أداة شيا-PET حزمة لفرز الفئات المختلفة 8. وسوف يستند هذا على شظايا الحمض النووي الموجودة في المكتبة. عموما، سوف شظايا أصغر رقاقة تعطي دقة أعلى وقطع لهذه المكتبات البلمرة RNA-PET شيا II حوالي 4 كيلو بايت.
وبالإضافة إلى ذلك، يمكن تمييز الحقيقي من التفاعلات لونين الضجيج العشوائي عن طريق حساب عدد من الحيوانات الأليفة ربط بين كتلة في التفاعل، وبعبارة أخرى، قال مجموعة من العد PET عالية لديها أعلى احتمال كونه تفاعل حقيقي لونين 8 .
لتصفية ايجابيات كاذبة لدينايرتفع من المراسي عالي التخصيب التي يمكن أن تشكل ربط بين الحيوانات الأليفة عن طريق الصدفة العشوائية، كما تم وضع إطار التحليل الإحصائي وضعت لتشكل تشكيل عشوائية من الحيوانات الأليفة أي ربط بين بين اثنين من المراسي 8.
في الختام، هذه التقنية تسمح شيا-PET رسم خرائط شبكات التفاعل لونين على نطاق عالمي. تنفيذ المعالج في شيا-PET يسمح في الحد من التعقيد ومكتبة ضجيج في الخلفية. وبالإضافة إلى ذلك، يضيف رقاقة خصوصية لونين التفاعلات، وتمكن من دراسة التفاعلات لونين المحددة المرتبطة عوامل النسخ خاص 5.
The authors have nothing to disclose.
يتم اعتماد الكتاب من النجم * من سنغافورة. وبالإضافة إلى ذلك، يتم اعتماد المنح الدراسية من قبل MJF النجوم A * الوطنية للعلوم، وهي لوريال للنساء في ميدان العلم الوطني وزمالة لي كوان يو زمالة ما بعد الدكتوراه. ويدعم ترميز YR من منح المعاهد الوطنية للصحة (R01-01 HG004456 وR01 HG003521-01). الكتاب نعترف أيضا فريق بالفيديو للإنتاج بكسل 8، سنغافورة، ولا سيما ايسي كلفن، والسيد تشانغ شيانغ كاي والسيد جان شيرون لتصوير المشاهد، السيدة ستي الرحيم لتحرير الفيديو والسيدة ميشيل تيو لل الصوت عبر.
Name of the reagent | Company | Catalogue Number | Comments |
4-20% gradient TBE gel | Invitrogen | EC6225BOX | Step B, 6.3 |
5 x T4 DNA Ligase Buffer with PEG | Invitrogen | 46300018 | Step B, 2.2 |
6% TBE gel | Invitrogen | EC6263BOX | Step B, 6.8 |
Agilent DNA 100 Assay | Agilent Technologies | 5067-1504 | Step B, 7.1 |
Agilent High Sensitivity DNA Assay | Agilent Technologies | 5067-4626 | |
Agilent Bioanalyzer 2100 | Agilent Technologies | G2940CA | |
Centrifuge Tube Filters (Spin-X) | Corning | CLS8160 | Step B, 3.7 and 6.9 |
Dark Reader Transilluminator | Clare Chemical Research | DR46B | Step B, 6.8 |
Digital Sonifier Cell Disrupter | Branson | 450D-0101063591 | Step A, 4.3 |
DynaMag-2 magnet (Magnetic Particle Concentrator) | Invitrogen | 123-21D | Step A, 7.5.1 Step B, for all magnetic beads washing steps |
DynaMag-15 Magnet (Magnetic Particle Concentrator) | Invitrogen | 123.01D | Step A, 5 and 6 |
DynaMag-PCR (Magnetic Particle Concentrator) | Invitrogen | 49-2025 | Step B, 6.5 |
Escherichia coli DNA Polymerase I | NEB | M0209 | Step B, 5.6 |
GlycoBlue | Ambion | AM9516 | Step A, 7.5.1 Step B, 4.3 and 6.5 |
Illumina cBot Cluster Generation System | Illumina | SY-301-2002 | Step B, 7.4 |
Illumina Genome Analyzer IIx | Illumina | SY-301-1301 | Step B, 7.5 |
Illumina PE primers | Illumina | PE-102-1004 | Step B, 5.4 (if necessary) |
Intelli-Mixer | Palico Biotech | RM-2L | Step B, any incubations with rotation |
LightCycler 480 Real-Time PCR System | Roche | 04 640 268 001 | Step A, 7.5.3 Step B, 7.3 |
LightCycler480 DNA SYBR Green I MasterMix | Roche | 03 752 186 001 | Step B, 7.5.3 |
M-280 Streptavidin Dynabeads | Invitrogen | 11206D | Step B, 5.2 |
Magnetic (Dynabeads) Protein G | Invitrogen | 100.03D | Step A, 5.1.1 and 5.2.1 |
MaXtract High Density (2ml) | Qiagen | 129056 | Step A, 7.5.1 |
MaXtract High Density (50ml) | Qiagen | 129073 | Step B, 4.2 |
MmeI | NEB | R0637 | R0637 |
RNase ONE Ribonuclease | Promega | M426C | Step B, 4.8 |
RNA Polymerase II (8WG16) monoclonal antibody | Covance | MMS-126R | Step A, 5.2.4 |
Oak Ridge Centrifuge Tubes (Polypropylene) | Nalgene | 3119-0050 | Step A, 3.1 |
Oak Ridge Centrifuge Tubes (Teflon FEP) | Nalgene | 3114-0050 | Step B, 4.3 |
Phusion High Fidelity Master Mix | Finnzymes | F-531 | Step B, 6 |
Picogreen (Quant-iT) dsDNA Reagent | Invitrogen | P11495 | Step A, 7.5.2 |
Polystyrene Round Bottom Test Tube | BD Biosciences | 352057 | Step A, 4.1 |
Protease Inhibitor Cocktail Tablets (cOmplete, EDTA-free) | Roche | 11873580001 | Step A, 1.6 onwards |
Proteinase K Solution (20mg/ml) | Fermentas | E00491 | Step A, 4.4, 7.5.1 Step B, 4.1 |
T4 DNA Ligase | Fermentas | EL0013 | Step B, 2.2, 3.9 and 5.4 |
T4 DNA Ligase Buffer (NEB) | NEB | B0202S | Step B, 3.3 and 3.9 |
T4 DNA Polymerase | Promega | M4215 | Step B, 1.2 |
T4 DNA Polynucleotide Kinase | NEB | M0201 | Step B, 3.3 |
TruSeq SBS Kit v5–GA | Illumina | FC-104-5001 | Regents for Illumina Genome Analyzer IIx system |
TruSeq PE Cluster Kit v2–cBot–GA | Illumina | PE-300-2001 | to be use with Illumina cBot Cluster Generation System |
SYBR Green I | Invitrogen | S-7585 | Step B, 6.3 and 6.8 |
XCell SureLock Mini-Cell Electrophoresis System | Invitrogen | EI0001 | Step B, 6.3 and 6.8 |
Name | Sequence | Comments | |
Biotinylated half-linkers A (200ng/μl) | Top | 5′ GG CCG CGA/iBiodT/ ATC TTA TCC AAC 3′ | 250 nmole scale HPLC Purified Internal Biotin dT(9) |
Bot | 5′ GTT GGA TAA GAT ATC GC 3′ | 250 nmole scale HPLC Purified | |
Biotinylated half-linkers B (200ng/μl) | Top | 5′ GGC CGC GA/iBiodT/ ATA CAT TCC AAC 3′ | 250 nmole scale HPLC Purified Internal Biotin dT(9) |
Bot | 5′ GTT GGA ATG TAT ATC GC 3′ | 250 nmole scale HPLC Purified | |
Non-biotinylated half-linkers (200ng/μl) | Top | 5′ GGC CGC GAT ATC GGA TCC AAC 3′ | 250 nmole scale PCR Grade |
Bot | 5′ GTT GGA TCC GAT ATC GC 3′ | 250 nmole scale PCR Grade | |
GS20 Adaptor A (200ng/μl) | Top | 5′ CCA TCT CAT CCC TGC GTG TCC CAT CTG TTC CCT CCC TGT CTC AGN N 3′ | 250 nmole scale PCR Grade |
Bot | 5’CTG AGA CAG GGA GGG AAC AGA TGG GAC ACG CAG GGA TGA GAT GG 3′ | 250 nmole scale PCR Grade | |
GS20 Adaptor B (200ng/μl) | Top | 5′ CTG AGA CAC GCA ACA GGG GAT AGG CAA GGC ACA CAG GGG ATA GG 3′ | 250 nmole scale PCR Grade |
Bot | 5′ CCT ATC CCC TGT GTG CCT TGC CTA TCC CCT GTT GCG TGT CTC AGN N 3′ | 250 nmole scale PCR Grade | |
Illumina-NN adaptors | Top | 5′ ACA CTC TTT CCC TAC ACG ACG CTC TTC CGA TC 3′ | 250 nmole scale HPLC purified See Step B, 5.4 |
Bot | 5′ phos – GAT CGG AAG AGC GGT TCA GCA GGA ATG CCG AG 3′ | 250 nmole scale HPLC purified Phosphorylated 5′ end See Step B, 5.4 | |
Illumina 1-454 (forward) primer (10 μM) | 5′ AAT GAT ACG GCG ACC ACC GAG ATC TAC ACC CTA TCC CCT GTG TGC CTT G 3′ | 250 nmole scale PCR Grade | |
Illumina 2-454 (reverse) primer (10 μM) | 5′ CAA GCA GAA GAC GGC ATA CGA GAT CGG TCC ATC TCA TCC CTG CGT GTC 3′ | 250 nmole scale PCR Grade | |
qPCR Primer 1.1 (10 μM) | 5′ AAT GAT ACG GCG ACC ACC GAG AT 3′ | 10nmole scale PCR Grade | |
qPCR Primer 2.1 (10 μM) | 5′ CAA GCA GAA GAC GGC ATA CGA 3′ | 10nmole scale PCR Grade | |
Illumina 3-454 sequencing primer (100 μM) | 5’TGC GTG TCC CAT CTG TTC CCT CCC TGT CTC AG 3′ | 100nmole scale HPLC Purified | |
Illumina 4-454 sequencing primer (100 μM) | 5’GTG CCT TGC CTA TCC CCT GTT GCG TGT CTC AG 3′ | 100nmole scale HPLC Purified |
Table of oligos and adaptors. Order oligos from Integrated DNA Technologies (IDT) and prepare linkers and adaptors in the same manner as described previously10. Half-linkers and adaptors may be prepared beforehand and stored for several months at -20 °C.