דיפוזיה Exocytosis לרוחב של חלבונים בממברנה של נוירונים בתרבית הוערכה באמצעות שחזור פלואורסצנציה Fluorescence מסופקים Photobleaching

1. תרבית תאים, פרידמן וקיבל הד עולמי ויראלי, ואת ביטוי חלבון תרבות גבוהה צפיפות נוירונים בהיפוקמפוס של גורים ביום 18 (E18) עובריים להלשין על פולי-L-ליזין מצופים coverslips זכוכית עבור 14-25 ימים במבחנה (DIV). 6-24hrs לפני הניסויים חיים, תאים transduce עם וירוס Sindbis נחלש המכילים חלבון הקרום של עניין, מתויג עם סופר האקליפטית pHluorin (ספטמבר). הוסף בינוני pseudovirion המכיל ישירות coverslip המכיל 1mL של התקשורת מיזוג וחזר חממה התרבות. Titer וזמן לביטוי חלבונים לאחר התמרה ויראלית ישתנה בהתאם אצווה וירוס יש לקבוע עבור כל אצווה לפני התחלת ניסויים תא חי. 2. FRAP-FLIP תא חי דימות ציוד הגדרת העברת coverslip לחדר ההדמיה של מיקרוסקופ Axiovert Zeiss 510 LSM META confocal.כדי למזער תנודות מתח במהלך ההדמיה, להבטיח את המיקרוסקופ כבר מופעל, עם פלט לייזר 100%, לפחות 20 דקות לפני הדמיה. מיד להחליף את אמצעי עם התרבות מחומם מראש (37 ° C) הקלטה פתרון תאי המכיל 140 mM NaCl, KCl 5 מ"מ, 15 גלוקוז מ"מ, 1.5 מ"מ CaCl 2, 1.5 מ"מ MgCl 2, 20-25 HEPES מ"מ (pH מותאם 7.4 עם NaOH) ומקום קאמרית על הבמה מראש מחוממת (37 מעלות צלזיוס) של Axiovert Zeiss. להבטיח את osmolarity של פתרון ההקלטה תאי מותאם בתוך mOsM 10 בינוני התרבות שלך. אם אין אידוי משמעותית מתרחשת במהלך timecourse של הניסוי, זה הפתרון CO 2 עצמאית מתאים ניסויים קצרים (פחות מ 10 שעות). עם השלמת נתרן ביקרבונט 1-2 mM מומלץ. הגדרת פרמטרים לכידת הדמיה ראשית, לזהות את הבעת העצב Pro רקומביננטיטיין העניין ולהביא אותו אל המוקד. עם שמן 63X התנגד, לרכוש תמונה של התא כולו באמצעות עירור 488nm אור לייזר לייזר בהספק נמוך. כדי למזער photobleaching, להשתמש במהירות הנומינלית מהר (7-9) ואת פיקסלים ברזולוציה נמוכה (512-512) שמירה על מהירות סריקה הכולל <1 2. בחר חלק דנדריט לתמונה וזום ללכוד מסגרת המכילה את ההחזר על ההשקעה (~ 1.5-2.5 זום אופטי X). במידת האפשר, להבטיח את שדה הראיה מכיל כמה תהליכים כדי מדידות של דנדריטים התייחסות ניתן להשיג, כדי לקבוע אם הלא ספציפית photobleaching בשל רכישת מתרחש. התאם את המסננים, חריר, מהירות סריקה רווח גלאי לאפשר הקרינה המרבית מ עירור הלייזר מינימלית אבל עם הרוויה מוגבלת. קוטר חריר גדול מומלץ, על מנת למקסם את אוסף פוטון (2μm מתאים קוצים והדנדריטים משולשת). רווח גלאי צריך להיות חזק מספיק כדי לזהות בהפרשים קטנים הקרינה,כך את התמונות הראשונות, לפני photobleaching לא להתגבר על 10% פיקסלים רוויים. שמור את התצורה הזו לשמש אקונומיקה שלאחר מראש / שלבי ההתאוששות של הניסוי. הבא להגדיר את האזורים photobleach, בחירת ההחזר על ההשקעה עבור photobleach הראשוני אזורים משני צדי לשלב photobleaching לאחר מכן חוזר על עצמו. להבטיח את האזורים משני צדי רחבים מספיק כדי למנוע שחזור של דיפוזיה בין סריקות (בדרך כלל 5 מיקרומטר, ראה איור. 2). להתאים את הפרמטרים של אקונומיקה ROIs הן photobleach. Photobleach הראשוני צריך להיות מהיר (0.1-0.5 שניות) המחייב בין 1-5 חזרות, תלוי זום אופטי היקף ההחזר על ההשקעה. עבור האזורים הסמוכים, עירור הלייזר צריך להיות מותאם על מנת להבטיח photobleaching רציפה האזורים הסמוכים, אך ללא נזק phototoxic. כקו מנחה, אנו משתמשים עירור הלייזר 100% עבור photobleach הראשוני, ו 10% עבור ה-pH photobleaching חוזר על עצמוASE. תמונה הרכישה ברגע שכל הפרמטרים נקבעו, לבצע את הניסוי FRAP-FLIP כרצף זמן לשגות משתנה התמונה, שתואר ב -4 בלוקים הבאים: BLOCK 1: 3-10 מראש אקונומיקה תמונות בסיסית, לייזר בהספק נמוך, אין זמן השהיה בלוק 2: Photobleach ההחזר על ההשקעה המרכזי כוח לייזר מלאה, 1-5 חזרות BLOCK 3: 3-10 שלאחר אקונומיקה תמונות התאוששות בלוק 4: photobleach חוזר של איגוף אזורים בכל הכוח לייזר בינוני עם לכידת תמונה במרווח זמן טיפוסי של 1 – 5 שניות, תלוי בקצב ההתאוששות של החלבון הנחקר. לבסוף, להחליף את פתרון ההקלטה עם תאי פתרון הקלטה שנאגרו על pH6 המכיל 140 mM NaCl, KCl 5 מ"מ, 15mm גלוקוז, 1.5 מ"מ CaCl 2, 1.5 מ"מ MgCl 2, 20-25 mM MES (כדי להרוות את הקרינה), או השלימו עם 50 מ"מ NH4Cl המכיל 90 מ"מ NaCl, KCl 5 מ"מ, 15 גלוקוז מ"מ, 1.8 מ"מ CaCl 2, 0.8 mMMgCl 2, 20-25 מ"מ, HEPES pH7.4 (כדי לחשוף את החלבונים בחנויות pH נמוך תאיים), (ראה איור. 2). לאסוף לפחות 10 עד 20 ערכות נתונים עבור כל חלבון רקומביננטי, כדי לאפשר ניתוח סטטיסטי. כדי למנוע תוצאות משוא פנים, להבטיח תנאים הדמיה נשמרים עקבי משכפל. לבטל את כל ערכות נתונים שלם שבו הלבנה, המטוס משמעותי להיסחף מרחק או נזק לתאים phototoxic הם נצפו. 3. ניתוח נתונים פתח את התמונות באמצעות תוכנת ImageJ. ליישר את ערימות לתת דין וחשבון על תנודות קטנות במישור xy, אשר ייתכן שאירעו במהלך הסדרה את השעה באמצעות תוסף Stackreg (plugins → stackreg → שינוי: הגוף נוקשה → ). עבור תמונות שצולמו על Zeiss confocal, השתמש תוסף ארגז כלים LSM לדווח על ערכי זמן כקובץ טקסט (plugins → LSM ארגז כלים → הצג LSM ארגז כלים → → ),ולייבא את הערכים הללו גיליון ניתוח. כדי למדוד את התנודות הקרינה במהלך הניסוי FRAP-FLIP, לחלק את קטע photobleached לאזורים פיקסלים בודדים (~~~HEAD=NNS 20pixels) ומודדים את הקרינה ממוצע של ROIs אלה בכל נקודת זמן (F). כדי להשיג במהירות את הערכים הללו, בחר ROIs מרובים באמצעות כלי ניתוח ImageJ "ההחזר על ההשקעה מנהל" (ניתוח → כלים → ROI Manager) ולדווח על הקרינה הממוצעת לכל פיקסל באמצעות "מגרש Z-ציר פרופיל" הפקודה (תמונה → ערמות → מגרש Z ציר פרופיל). חזור על פעולה זו כדי למדוד את עוצמת הקרינה של אזור רקע, ללא ניאון. לנרמל את עוצמת הקרינה בכל נקודת זמן על ידי הפחתת ערכי רקע להסיר רעש ניסיוני, ולחלק את כל הערכים לפי מדד מראש מולבן הממוצע בתחילת המחקר. למדוד את עוצמת הקרינה הלא photobleached דנדריטים סמוכים על מנת להעריך את רמת שאינו ספציפיphotobleaching במהלך הרכישה. תיקון עבור photobleaching הלא ספציפית אינה רצויה על הפרשנות של הנתונים "FRAP כפכפי" יש להימנע ככל שניתן. כדי לחשב אם התאוששות משמעותית שחל ההחזר על ההשקעה, לחסר ממוצע של צעדים 5-10 האחרונות של רצף מממוצע הצעדים הראשונים (5-10 ΔF) ולקבוע מובהקות סטטיסטית. לקטגוריות ROIs מחלים ולא מחלים להעריך את דפוס exocytosis (נקודות חמות exocytosis IE או עמוד השדרה לעומת התאוששות פיר). 4. נציג תוצאות התוצאה של הניסוי FRAP-FLIP טיפוסית מוצג באיור. 2. כאן, נוירון להביע למקטע GluA2 של קולטן מסוג AMPA גלוטמט, הוא מסומן ספטמבר כבר photobleached סלקטיבי יחד באזור של דנדריט. איור 2.A ממחיש את האזור של דנדריט אשר צילמו ומציין כי ROIs נבחרו photobleaching (אזורים קופסה לבנה). הדואר גדול באזור התאגרף לבן מולבן פעם אחת, ולאחר מכן חוזר על עצמו הלבנת האזורים משני צדי בארגזים, הדגיש עם כפולים חיצים כחולים ראשים. החץ האדום מציין את ההחזר על ההשקעה מדוד, שמוצג בהגדלה גבוהה את לוחות נמוכות יותר. איור 2.B, מראה את עוצמת הקרינה ב ההחזר על ההשקעה נמדדת במשך זמן הניסוי. בדוגמה זו, תקופת ההחלמה דקה נרשמה לאחר photobleach הראשונית לאפשר קולטנים מולבן להזין את ההחזר על ההשקעה על ידי דיפוזיה לרוחב. כאשר האזורים משני צדי הם photobleached, אותות הקרינה מתוך חלק זה ניע ביותר של קולטני הוא סתם את מאזור המרכז, ואלה בתוך האזור הם בדילול החוצה. הגידול הקרינה (ΔF) נצפתה על פני רצף "פליפ" ולכן ניתן לייחס את ההכנסה של ספטמבר-GluA2 בפיר הדנדריטי. לשטוף את ה-pH נמוך pH 7.4 + בנוסף NH4Cl בהתאמה לאשר את הקרינה שנמדד נגזר מפני השטחחלבונים לחשוף את חלקם של חלבונים תאיים, מושבים בתוך ההחזר על ההשקעה הנמדד. בניגוד FRAP, מתודולוגיה זו מבודדת את ההתאוששות בשל exocytosis, והתוצאה היא ברמה פחותה בהרבה של התאוששות הקרינה באזור photobleached. נכון להיום אין מודל מתמטי אמין פותחה כדי להתאים ולנתח את ההתאוששות שנרשמה עוקב באמצעות טכניקה זו להלבנה סלקטיבית. זהו עם זאת, ניתן להתאים את עקבות התאוששות עם התאוששות מונו מעריכית: F (t) = S – ה 0 (-t / τ) איפה F (t) היא הקרינה בזמן t, s ערך למצב יציב, 0 הוא לקזז בזמן 0, τ הוא זמן קבוע. הצמיחה התאוששות קבוע עם שיעור שניתן להגיע לשיווי משקל, המתאים למצב יציב בין הכניסה ודיפוזיה. חשוב לציין, קבוע זמן זה מופקnalysis אינו משקף את זמן קבוע של exocytosis והוא יכול לשמש רק עבור טיפולים ההשוואה חלבון יחיד. יתר על כן, דפוס צפויה התאוששות הקרינה עלולה להיות שנצפתה תתי תחומים יחד באזור photobleached. ניתוח של ההחזר על ההשקעה קטן במגזר photobleached עשוי להיות חיוני כדי לחשוף exocytosis "נקודות חמות" והוא מומלץ לנתח אזורים באורכים דומים כמו השתנות של צפיפות של כתמים אלה בקרב דנדריט ישפיע על שיעור מחושב. איור 3 מציג הרחבה של פרוטוקול זה, יישום photobleach את ההחזר על ההשקעה בחלק גדול עם דנדריטים רבים בתחום הראייה, ולאחר מכן חוזרת סלקטיבית של הלבנת דנדריט אחד בלבד. גישה זו מאפשרת "FRAP" מסורתיים נתונים "FRAP כפכפי" להיות שנרכשו במקביל. בדוגמה זו, נוירונים בהיפוקמפוס נדבקו למקטע קולטן הגלוטמט הכיתה kainate: ספטמבר, מתויג GluK2. PrioR כדי הדמיה, הנוירונים למוצרי היו אלה שטופלו cylcohexamide (2hrs ב 200μg/ml), לחסום את סינתזת החלבון. כמו התאוששות כזאת, הקרינה ב ROIs נמדד בהתאמה (איור 3.B) חושף את שיעור ההחלמה עקב דיפוזיה מיחזור לרוחב ו דנדריט FRAP מיחזור תקן לעומת לבד דנדריט נתון פרוטוקול "FRAP כפכפי". השוואת הערכים ΔF של עקומות "FRAP כפכפי" FRAP לעומת השחזור, את התרומה היחסית של מיחזור (ΔF rec = 11.05%) לעומת לרוחב דיפוזיה (ΔF הבדל = 9.35%) ניתן להסיק. שלא כמו איור 2, התאוששות אינה לשמור על רמה מצב יציב, אלא, בשל עיכוב של סינתזת חלבון, מראה עלייה חולפת ובעקבות ירידה-off של האות, המתאים דלדול של מאגר הקולטן זמין (כ 20% נצפתה ירידה במשך הקלטה). </p> באיור 1. סכמטי של עקרונות FRAP לעומת FRAP כפכפי פרוטוקולים סכמטי זה מדגים את התוצאות של FRAP קבוע לעומת פרוטוקול "FRAP-פליפ", תוך שימוש בספט 'מתוייגים קולטנים. שחזור הקרינה ב FRAP המסורתית מוצגת בצד שמאל. שחזור הקרינה הנמדדת ההחזר על ההשקעה המרכזי מיוחסת לשילוב של פריץ לרוחב דיפוזיה לא photobleached קולטנים ספטמבר, מתוייגים מבחוץ ROI photobleached ואת הכניסה של קולטני באמצעות מיחזור ו / או דה נובו exocytosis לתוך פיר הדנדריטי. לעומת זאת, חוזרת ונשנית של photobleached ROIs איגוף לידי ביטוי בצד ימין, מראה עד כמה זה שונה "FRAP כפכפי" שתיקות פרוטוקול בשל התפשטות לרוחב התאוששות. לפיכך, שחזור כל הקרינה הנמדדת ניתן לייחס את ההכנסה ישירה ההחזר על ההשקעה. איור 2.הכניסה של ספטמבר-GluA2 לתוך קרום פלזמה על מוט הדנדריטי א) תא עצב בהיפוקמפוס להביע ספטמבר, GluA2, photobleached סלקטיבי יחד באזור של דנדריט. סכמטית ממחיש את האזור של דנדריט אשר צילמו, בעוד הפאנל העליון השמאלי מדגיש את ROIs כי נבחרו photobleaching. שטח גדול התאגרף לבן מולבן פעם אחת, ולאחר מכן חוזר על עצמו הלבנת האזורים משני צדי בארגזים, הדגיש עם כפולים חיצים כחולים ראשים. לוח זה מציג את דנדריט לפני photobleaching. החץ האדום מציין את ההחזר על ההשקעה מדוד, שמוצג בהגדלה גבוהה את לוחות נמוכות יותר. ב) מראה את עוצמת הקרינה ב ההחזר על ההשקעה נמדדת במשך זמן הניסוי, החליט ככל שרמת אפור ההחזר על ההשקעה (לא מנורמל). החץ השחור להדגיש timepoint של photobleach הראשוני החץ הירוק מציין את ההתחלה של photobleaching חוזר על עצמו. ΔF מציין הדואר הגדלת הקרינה נצפתה על תקופת ההחלמה, בשל הכניסה של ספטמבר-GluA2 לתוך פיר הדנדריטי. PH נמוך בעקבות ו pH 7.4 + NH 4 Cl שוטף לוודא את הקרינה התאושש מתייחס פני השטח קולטנים לידי ביטוי. איור 3. מיחזור & דיפוזיה לרוחב לעומת מחזור של ספטמבר-GluK2 על פיר הדנדריטי בעקבות הטיפול cyclohexamide א) תא עצב בהיפוקמפוס להביע ספטמבר, GluK2, photobleached סלקטיבי עם FRAP במקביל ופרוטוקולים התאוששות "FRAP כפכפי" שבוצעו לאורך ROIs הדנדריטים נפרד. תא עצב זה היה נתון המקדים עם cyclohexamide, כדי לחסום את סינתזת החלבון (2 שעות על 200 מיקרוגרם / מ"ל). סכמטית ממחיש את האזור של דנדריט אשר צילמו, ואילו לוח יד שמאל הדגשת ROIs כי נבחרו photobleaching. הדואר גדול באזור התאגרף לבן מולבן פעם אחת, ולאחר מכן חוזר על עצמו הלבנת האזורים הסמוכים, בארגזים של דנדריט נמוכה בלבד, הדגיש עם כפולים חיצים כחולים ראשים. לוח זה מציג את הדנדריטים לפני photobleaching. חיצים אדומים להדגיש את ROIs שמוצג בהגדלה גבוהה ב) הממחישות את ההתאוששות הקרינה ב FRAP המסורתית לעומת פרוטוקול "FRAP כפכפי". השוואת רמות של עוצמת הקרינה בשלב מאוחר של שחזור (לוחות שלישי) להראות את התרומה של דיפוזיה מיחזור לרוחב, לעומת מחזור לבד. C) מראה את עוצמת הקרינה ב ROIs נמדדת במשך זמן הניסוי, החליט כמו עוצמת מנורמל ערכים. החץ השחור להדגיש timepoint של photobleach הראשוני החץ הירוק מציין את ההתחלה של photobleaching חוזר על עצמו. ΔF rec מציין התאוששות זמנית עקב מיחזור הקולטן, נקבע בין דנדריט FRAP / פליפ תוך ΔFהבדל מודד את התרומה של פיזור רוחבי של ספטמבר-GluK2 לתוך פיר הדנדריטי ב 'FRAP רק "ההחזר על ההשקעה. גידול זמני ואחריו ירידה הדרגתית האות, המתאים בטווח מטה של ​​קולטני זמינים כתוצאה של טיפול cyclohexamide. PH נמוך לאחר מכן ו pH 7.4 + NH 4 Cl שוטף לוודא את הקרינה התאושש מתייחס פני השטח קולטנים לידי ביטוי.