Isolamento e la coltura di cellule umane Gusto papille fungiformi
Summary
Abbiamo puntato a sviluppare un protocollo riproducibile per isolare e mantenere a lungo termine colture di cellule umane papille gustative fungiformi. Le cellule di papille fungiformi umana ottenuti con la biopsia sono stati correttamente mantenuti in coltura per più di otto passaggi (12 mesi) senza perdita di vitalità.
Abstract
Gusto cellule sono altamente specializzati, con uniche istologiche, caratteristiche molecolari e fisiologiche che permettono il rilevamento di una vasta gamma di stimoli semplici e complessi molecole chimiche contenute negli alimenti. In umana, individuale papille fungiformi contengono da zero a un massimo di 20 papille gustative. Non vi è alcun protocollo stabilito per cellule gustative coltura umane, anche se la capacità di mantenere papille gustative cellule in coltura per più cicli cellulari sarebbe di notevole utilità per caratterizzare le proprietà molecolari, rigenerativa, e funzionali di queste cellule uniche sensoriali. Gli studi precedenti di cellule gustative sono stati condotti utilizzando cellule isolate fresco in coltura primaria, culture espianti da roditori, o semi-intatte le papille gustative in fette di tessuto 1,2,3,4. Sebbene ciascuna di queste preparazioni di vantaggi, lo sviluppo delle colture a lungo termine avrebbe fornito vantaggi significativi, in particolare per studi di proliferazione cellulare gusto e differentiation. Diversi gruppi, compreso il nostro, sono stati interessati nello sviluppo e nella definizione di modelli di coltura delle cellule gustative. La maggior parte dei tentativi di cellule gustative della cultura hanno riferito di agibilità limitata, con cellule di solito non durano oltre il 3-5 d 5,6,7,8. Recentemente abbiamo segnalato su un metodo di successo per la cultura estesa di cellule gustative roditore 9. Noi qui riferire per la prima volta l'istituzione di un sistema di coltura in vitro di cellule umane isolate papille gustative fungiformi. Le cellule di papille fungiformi umana ottenuti con la biopsia sono stati correttamente mantenuti in coltura per più di otto passaggi (12 mesi) senza perdita di vitalità. Cellule visualizzato molte caratteristiche molecolari e fisiologiche caratteristici delle cellule mature gustative. Gustducin e fosfolipasi C β2, (β2-PLC) mRNA sono stati rilevati in molte cellule di trascrittasi inversa-reazione polimerasica a catena e confermato tramite sequenziamento. Analisi immunocitochimica dimostrato la presenza di rafficaespressione ducin e PLC-β2 in coltura cellule gustative. Colture di cellule umane fungiformi anche mostrato un aumento del calcio intracellulare in risposta a stimoli concentrazioni appropriate di diversi gusti e indicano che i recettori gusto e almeno alcune delle vie di segnalazione erano presenti. Questi risultati indicano che sufficienti cellule gustative di esseri umani adulti può essere generata e mantenuta per almeno otto passaggi. Molte delle cellule conservano caratteristiche fisiologiche e biochimiche di cellule isolate dal acutamente l'epitelio gusto degli adulti per sostenere il loro uso come sistema modello di gusto. Questo sistema consentirà ulteriori studi dei processi coinvolti nella proliferazione, differenziamento e la funzione delle cellule di mammifero recettori gusto in un preparato in vitro.
Umano papille gustative fungiformi utilizzato per la determinazione umana coltura cellulare fungiformi sono stati donati per la ricerca, seguendo le apposite consenso informato ai sensi dei protocolli di ricerca che sono stati recensionee approvato dal comitato IRB. Il protocollo (# 0934) è stato approvato dalla Schulman Institutional Review Board Associates Inc., Cincinnati, OH. Protocollo scritto qui di seguito si basa su parametri pubblicati segnalati da Ozdener et al. 2011 10.
Protocol
Discussion
Abbiamo mantenuto cellule ottenute da papille fungiformi gusto umano per oltre 8 brani, che coprono un periodo di 12 mesi. Queste colture generano nuove cellule, molti dei quali maturazione in vitro allo stadio dove esprimono marcatori diversi tipi di cellule adulte gusto germoglio, oltre a chiave proprietà molecolari e fisiologiche di cellule recettori gustative. La presenza di gustducin e PLC-β2 immunoreattività in sottogruppi di cellule in coltura è coerente con questa conclusione. La cosa più important…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo Aimee Myers e Quayson Esi per le competenze tecniche e di aiuto. Questo lavoro è stato sostenuto in parte da NSF 0216310 e Givaudan Inc sovvenzione (NER).
Materials
| Name of the reagent | Company |
| MCDB 123 | Sigma-Aldrich |
| Iscove’s DMEM Medium | MediaTech |
| Elastase | Sigma-Aldrich |
| Pronase E | Sigma-Aldrich |
| Elastase | Worthington |
| Soy bean trypsin inhibitor | Worthington |
| Collagenase type 1 | Worthington |
| Rat tail collagen type 1 | BD Sciences |
| Fura-2 AM | Molecular Probes |
| Superscript First Strand Synthesis System for RT-PCR | Invitrogen |
| Leica TCS SP2 Spectral Confocal Microscope | Leica Microsystems Inc. |
| Discovery-1 imaging station and Metamorph software | Molecular Devices |
| Small fine-tip forceps and extra fine spring scissors | Fine Science Tools |
References
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