臨床抗体サンプルの貪食活性を決定する

1。文化食細胞文化THP – 1 Tフラスコに固定懸濁液として10％ウシ胎児血清を添加したRPMI 1640で10セル。細胞密度は、FcγRの発現とアッセイの性能の一貫したレベルを維持するために、0.5 × 10 6 / mL以下に維持されるべきである。 2。ビオチン化抗原を準備製造元の指示に従って、目的の標的抗原をビオチニル化するために必要なスルホ- NHS LCビオチン試薬キットの量を計算します。 水中でのビオチン化試薬を溶解し、すぐに第一級アミンを含まないバッファーで抗原に計算した金額を追加してください。反応が時折混ぜ、室温で1時間進行することができます。 タージェを維持するために適切な分子量のカットオフのアミコン遠心濃縮装置に緩衝液交換によって過剰、非抱合型ビオチンを削除します。T抗原。濃縮ユニットの上部チャンバーにサンプルを追加し、15 mLの充填ラインへの総ボリュームを起動するPBSを加える。約1.5 MLSにボリュームをダウンさせるために4000 × gで遠心する。この処理を繰り返すと、二回ビーズに抗原の最大塗膜を確保するための遊離ビオチンの99％が削除されます。 3。抗原飽和ビーズを準備高速遠心機でスピンダウン後、1 mlの0.1％PBS – BSAで二回1ミリメートル蛍光ニュートラビーズ100μlを洗う。再懸濁し、10のチューブに100μlのPBS – BSA、および一定量のビーズを洗浄した。 ビーズを飽和させる抗原のコーティングの条件を決定するために、二倍のステップでビオチン化抗原の濃度を変化させて洗浄したビーズ懸濁液10 ulを組み合わせる。ローテーター上でマイクロ遠心チューブに4℃で一晩インキュベートする。 注：ビーズの彩度を実験的に決定する必要があります。これを達成することができるビーズが続いてコントロールモノクローナル抗体でオプソニンしているときに最大の食作用をもたらすビードコーティングの条件を識別することによって。 ビーズのペレットになるまで高速で1 mLのPBS – BSAと遠心で洗浄して非結合抗原を削除します。 PBS – BSAを削除して、繰り返します。 PBS – BSAに1 mlの最終容量に再懸濁し、抗原をコーティングしたビーズ。ビーズは4℃の週に使用する° Cの前まで保存することができます。 4。抗体のサンプルを準備する臨床抗体のサンプルは、メーカーの指示に従ってメロンゲルのIgG精製キットを用いて血漿から精製することができる。精製したIgGは4℃で使用直前まで保存することができます。 注：ヒトサンプルを扱うに関する適切な対策を常に取られている必要があります。 A280の吸光度で精製抗体の濃度を決定し、PBSで1 mg / mlにサンプルを希釈する。 置かれているものを準備PBSで1 mg / mlまで希釈して、IVEと負のモノクローナルコントロール抗体。 5。実験をめっきボルテックスで上記で調製した洗浄、抗原飽和ビーズ溶液を再懸濁し、そして丸底96ウェルプレートの各ウェルに10μlを移す。ケアは、継続的に蛍光ビーズの等しい数を確保するためにビーズ懸濁液を撹拌するために注意しなければなりません各ウェルに添加されています。 各抗体の用量 – 反応曲線を作成し、各ウェルに関心の抗体の濃度を変化させて追加します。最適な濃度が存在する抗体の力価に応じて、サンプル間で異なりますが、0.01から100μg/ mlの最終濃度の範囲は、良好なカバレッジを提供し、関心の濃度範囲の同定が可能になります。抗体を20μlのより大きくないボリュームで追加されていることを確認します。 ° Cの抗体がビーズをオプソニン化するために可能にするために37℃で2時間ビーズと抗体のサンプルをインキュベートする。</ LI> 2.5 × 10 5細胞/ ml、でのTHP – 1細胞の懸濁液を調製し、各ウェルに5 × 10 4 THP – 1細胞の合計で、各ウェルにこの懸濁液200μlを加える。 37℃で一晩インキュベート℃、5％固定インキュベーター内でCO 2、、重力を経由してペレットにできるように、細胞とビーズ。 注：ノイズへの信号が最適なビーズを決定することによって改善する場合があります：抗体：THP – 1特定の抗原と抗体ソースの細胞比。 6。フローサイトメトリー解析各ウェルの細胞ペレットを乱さないように注意してから上清100μlを削除します。サイトカイン分泌の決定または他の分析が望まれる場合上清を保存することができます。 固定の場合は、細胞を再懸濁し、混合するために各ウェルにピペットを4％パラホルムアルデヒド100μLを加える。 ハイスループットフローサイトメトリー分析は、HTSプレートリーダーを搭載したBD LSR IIを使用して実行することができます。プログラムソフトウェアは、各ウェルの3倍（100μlの混合量）を混合し、各サンプル30μlの、または少なくとも2000のセルのイベントを、分析する。 収集されたデータは、FlowJoまたは同等のソフトウェアで解析することができます。有用なメトリックは、ビーズ+のパーセント、または蛍光細胞、現在の食細胞の数の尺度を提供するだけでなく、貪食ビーズの数の尺度を提供する食細胞の蛍光強度が含まれています。これらの値を乗算すると、統合された平均蛍光強度、またはiMFIを生成します。 それぞれの食細胞によって貪食ビーズの平均数は1ビーズの平均蛍光によってiMFIを割ることによって計算することができます。 7。代表的な結果影響を受けると影響を受けない被験者からの抗体サンプルの明確な差別があるはずです。図1Aは、HIVネガから抗体サンプルのFACSヒストグラムを提示tive（黒のトレース）とHIVポジティブ（グレーのトレース）の対象、および抗原特異的抗体の存在によって駆動増加食作用を示しています。 アッセイの最適な感度はビオチン化抗原とビーズの飽和に依存しています。図1Bは、抗原の異なる量でコーティングされたビーズが（非結合抗体、三角形含む）3コントロールモノクローナル抗体でオプソニンされたときに観測された貪食を提示し、この抗原に対して飽和濃度として2μg抗原/μLビーズを確立します。 用量 – 反応曲線を図2に提示され、0.05から5μg/ mlの抗体の濃度範囲で貪食を誘導するために対象抗体サンプルの微分容量を示しています。この差の貪食は、IgGサブクラスとグリコシル化状態などの力価又はFcドメインの特性の違いのどちらかによって駆動されることがあります。 THP – 1細胞​​は、私している場合magedは、蛍光顕微鏡により、ビーズ貪食の明確な証拠がある。図3は、抗体の非存在下で貪食取り込みの欠如を示す抗体オプソニン化（緑）と非オプソニン化（赤）ビーズとのインキュベーション後のTHP – 1細胞​​、の二つ63x静止画像を提示。タイムラプス顕微鏡が実行されると、蛍光ビーズの抗体特異的貪食取り込みは（動画1、20倍の倍率）はさらに顕著です。 前の仕事は、セルに関連付けられているビーズの内在化を認識しています、と主単球を用いた実験では、このハイスループットアッセイ（データは示さず）に貪食スコア（iMFI値）とよく一致している。 図1。アッセイの品質管理。 1A、HIV陰性対象（黒のトレース）とHIV陽性被験者（グレーのトレース）から抗体のサンプルの貪食のフローサイトメトリーのヒストグラム。1B：サンプルの抗原のための最適なビードコーティング条件の実験的決定。抗原特異的なモノクローナル抗体（円、正方形）はビーズの> 2μgの抗原/μlでコーティングしたビーズの最大の食作用を示し、対照抗体ながら、（三角形）は貪食能を示していない。 図2。貪食用量-反応曲線。差HIVポジティブ（処理、未処理、および抗レトロウイルス療法の不在下でウイルス複製の制御を示す）とgp120のHIV陰性の被験者のドライブの貪食（HIVのエンベロープ）をコーティングしたビーズから臨床抗体サンプル。 図3。効率的な内部化。非オプソニン化ビーズは、ゾル中に残したまま顕微鏡では、抗体-オプソニン化ビーズ（緑）の内在化を確認ution（63x倍率）。 映画は1。抗体主導貪食のタイムラプス顕微鏡は、14時間かけて行い、ハイスループットアッセイで使用するTHP – 1細胞の貪食能の可視化を可能にした。緑色蛍光ビーズは抗体オプソニンである、赤色蛍光ビーズは、負の制御を提供します。 映画を鑑賞するためには、ここをクリック。