İskelet Kası Cinsiyet Proteomik Dimorfizm

1. Örnek hazırlama Başlangıç ​​malzemesi olarak farelerden elde edilen taze, flaş dondurulmuş veya RNAlater ile tedavi edilen doku kullanın. Devam etmeden önce bir Kimwipe ile herhangi bir aşırı koruyucu kurutun. Çevresindeki tüm tendon ve kas fasya çıkarın ve doku doku, iyi kıyılmış veya toz kadar bir soğuk oda (4 ° C) 2 dakika süreyle soğuk cam plakalar üzerine tek kenarlı Jilet ile kıyma. Önceden tartılmış mikrofuge'ye tüp örnek toplayın ve doku ağırlığı belirlemek. Başlangıç ​​materyali olarak en fazla 10 mg doku kullanın. Oda sıcaklığında 1 mg kıyılmış doku başına 45 mcL ekstraksiyon tamponu (8 M üre, 50 mM DTT,% 4 ahbap,% 0.2 taşıyıcı ampholytes 5 / 8, 0.0002% Bromophenol Mavi) ekleyin. Hacmi 350 mcL daha büyükse, başlangıçta 350 mcL ekleyin ve homojenize (adım 1.4), daha sonra sıçramasına en aza indirmek için tampon geri kalanını ekleyin. 15 saniye için doku motorlu havaneli (Kontes Corp) ile yedi kez homojenize4 ° C, iki dakika her homojenizasyon arasındaki buz üzerinde soğutma ile. 4 30 dakika 15.600 xg örnekleri Santrifüj ° C Süpernatantı kaydedin ve hacmini ölçmek. Hücre enkaz pelet atılır. Buz gibi reaktif dereceli aseton (v oranı 3 kat v) süpernatantı proteinlerin çöktürün. 15 saniye vorteksleyin. Pelet formu ve Kontes motor ve polipropilen karıştırma çubukları (BioSpec Remix) ekstraksiyon tamponu ile tekrar süspansiyon 15.600 xg 10 saniye süreyle santrifüj Adım 1.6 tekrarlayın. Ya örneklerin protein konsantrasyonu tahmini ile devam ya da -20 ° C'de saklayın 2. Protein konsantrasyonu tahmini Yaklaşık 4,5 mg ml -1 amacı; Lowry tahlil 7 veya BCA tahlil 8 (Pierce) kullanın. 3. Odaklama İzoelektrik ReadyStrip IPG şeridi çıkarın (11 cm, pH 5-8, Bio-Rad)-20 ° C ve 10-15 dakika süreyle RT gelmesini sağlayınız. Vorteks protein örnek örnek örnek rehidrasyon tepsisini bir kanal arka kenarında düz bir çizgide ve pipet 600-800 mg (toplam hacmi 200 mcL), yaklaşık 1 cm bırakarak her iki ucunda. Forseps kullanarak, IPG şerit plastik kapak kalkmasına şerit uçları sadece sap ve jel ile herhangi bir teması önlemek için emin olun. Not ve şerit temel tepsisinin sol tarafındaki pozisyon. Örnek üstünde aşağı IPG şerit jel tarafı yerleştirin, yakalama kabarcıkları altında kaçının. Bir saat rehidrate izin ver. 2.5 mL mineral yağı (BioRad) Overlay. Tepsisi kapağı, kapak ve oda sıcaklığında bir gece rehidrate bırakın. Odaklama tepsi kanalın her iki ucunda bir kağıt fitil yerleştirin ve her biri 10 mcL Millipore su ile ıslak. Şerit IPG çıkarın ve yağ tahliye için yaklaşık 10 saniye dikey olarak tutun. Leke plastik bKimwipe ile acking. IPG şerit jel yan odaklama tepsisinde aşağı ve sola temel sonuna yerleştirin. Şerit 2.5 mL mineral yağı ile kaplayın. Protean IEF hücreli (Bio-Rad) ve program varsayılan 20 hücre sıcaklığında 3 aşamalı bir protokol (Tablo 1) tepsiye yerleştirin ° C, 50 uA / şerit ve rehidrasyon süresi maksimum akım. Gerilim Zaman Volt-Saat Rampa Adım 1 250 20 dk. Doğrusal Adım 2 8.000 2.5 saat Doğrusal Adım 3 8.000 40.000 Hızlı Toplam 6.5 saat 40.000 Tablo 1. Üç adım 11 cm şeritler IPG Protean IEF hücre protokolü. IPG şeritler forseps kullanarak IEF hücre dışına çekin. Kimwipe ile plastik desteğini Blot ve IPG şerit jel tarafı, temiz bir rehidrasyon tepsiye yerleştirin. Rehidrasyon tepsi örtüsü ve plastik wrap ve mağaza ile sarın – 80 ° C veya devam edin. 4. SDS-poliakrilamid jel elektroforezi Şerit (jel tarafı yukarı) 11 cm dengeleme tepsisine aktarın. Kanala azalma tamponu (6 M üre,% 2 SDS, 0.05 M Tris / HCl, pH 8.8,% 20 gliserol,% 2 DTT) 4 mL ekleyin ve hafif sallayarak 10 dakika için şerit dengeye. Azaltılması tamponu çıkarın, alkilleme tamponu (6 M üre,% 2 SDS, 0.05 M Tris / HCl, pH 8.8,% 20 gliserol,% 2,5 iodoacetamide) 4 mL ekleyin ve hafif sallayarak 10 dakika için şerit dengeye. Stri daldırma IPG şerit durulayın1 X SDS çalışan tampon p kısa bir süre (25 mM Tris, 192 mM glisin,% 0.1 SDS, pH 8.2). 11 cm arka plaka üzerine şerit jel yan yatırın Kriter prekast 10.5% -14% Tris-HCl SDS-poliakrilamid jel (Bio-Rad) ve SDS jel ile tam temas edinceye kadar yavaşça itin; iki jel yüzeyler arasında sıkışıp hava kabarcığı emin olun. 1 ml (% 0.5 agaroz, 25 mM Tris, 192 mM glisin,% 0.1 SDS, Bromophenol Mavi) erimiş agaroz çözüm IPG şerit Yerleşimi ve agaroz 5 dakika boyunca katılaşmaya izin. Molekül ağırlığı standartları olarak tek bir kuyunun içine protein marker 5 mcL 10-225 kDa (76.740 USB, P / N) yükleyin. Oda sıcaklığında 200 V veya jel elektroforez izlemek için Bromophenol Mavi boya ön göç kullanarak bir soğuk oda (4 ° C) SDS tamponu (25 mM Tris, 192 mM glisin,% 0.1 SDS, pH 8.2) çalıştırın. Plastik dökme jel çıkarın ve geceleme Coomassie Brillant Blue hafifçe sallayarak lekeR-250 (% 45.5 metanol,% 45.5 dH2O,% 9.0 asetik asit,% 0.25 Coomassie Brillant Blue R-250) leke. 3 saat gecede her bir ve Destain 2 (% 5 metanol,% 90 dH 2 O,% 5 asetik asit) için jel Destain 1 solüsyonu (% 45.5 metanol,% 45.5 dH 2 O,% 9.0 asetik asit) iki kez çalkalayın . Analiz için% 7 asetik asit jel saklayın. 5. Jel görüntüleme ve analiz VersaDoc görüntüleme sistemi (BioRad) faaliyet Miktar Bir yazılım programı kullanarak jeller, görüntüler yakalayın. Denemenizi tüm jeller için düzgün görüntü alanları kırpın. Bir deney seti oluşturmak için kırpılmış görüntüleri PDQuest 8.0 yazılım programı yükleyin. Nokta tespiti ve jeller arasında eşleştirme nokta için parametreleri tanımlamak için Deney kurulum sihirbazı izleyin. Kontrol edin ve gerekirse elle sonuçları eşleşen spot rafine. Tw ile eşleşen protein noktaları tespit etmek için jeller nicel ve istatistiksel analiz yapıniki jel grupları arasında ifade o kat veya daha yüksek istatistiksel olarak anlamlı farklılıklar. Bu ilgi çekici noktalar ile bir analiz oluşturun ve tripsin sindirim ve LC-MS-tabanlı protein belirlenmesi için bir EXQuest spot kesici (BioRad) kullanarak bunları kesip. 6. Jel triptik sindirim Bu adımı modifiye Pierce-Gel Triptik Digest Kit (# 89871X, Pierce) protokolü kullanılır. Jel fişler destaining çözüm (25 mM amonyum bikarbonat,% 50 asetonitril) 200 mcL ekleyin. Vortex ve 37 ° örnekleri inkübe ° C ile 30 dakika boyunca sallayarak. Çözüm dikkatlice çıkarın ve atın. 6.1 adımı tekrarlayın. Taze hazırlanmış azaltarak tamponu (50 mM Tris [2-carboxyethyl] fosfin, 22.5 mM amonyum bikarbonat), 60 ° C'de 10 dakika jel fişler ve inkübe içeren tüplere 30 mcL ekle Örnekleri soğutmak için izin ver; sonra çıkarın ve indirgeyici tampon atın. Alkilleme tamponu (folyo sarılı tüpler içinde hemen önce hazırlanan 100 mM iodoacetamide, 20 mM amonyum bikarbonat, 30 mcL ekleyin. Oda sıcaklığında 1 saat süreyle karanlıkta örnekleri inkübe edin. Alkilleme tamponu çıkarın ve atın. Her tüp çözüm destaining 200 mcL ekleyerek jel fişler yıkayın. 37 örnekleri ° C'de 15 dakika boyunca. Destaining çözüm çıkartın ve atın ve yıkama tekrarlayın. Jel fişler asetonitril 50 mcL ekleyin ve onları kuru küçültmek için izin oda sıcaklığında 10 dakika inkübe sonra asetonitril dikkatlice çıkarın. Adım 6.8 kez daha tekrarlayın. Jel adet beyaz ve küçük bir bakmak gerekir. Jel parçaları 10 dakika Centrivap Konsantratörü (Labconco Model EX1245) kurumasını bekleyin. 10 mcL aktif tripsin çözeltisi (10 ng / ml tripsin, 25 mM amonyum bikarbonat) eklenerek jel parçaları şişer. 15 m için oda sıcaklığında inkübeinutes. Tüpler 25 mcL sindirim tamponu (25 mM amonyum bikarbonat) ekleyin. Örnekleri sallayarak bir gecede oda sıcaklığında inkübe edin. 10 dakika örnekleri sonikasyon (Branson, banyo sonikatör modeli 2510) ve yeni bir tüp süpernatant çıkarmadan önce onları aşağı doğru döndürün. Süpernatantı kaydedin. Peptidler daha ayıklamak için, titreme 5 dakika boyunca oda sıcaklığında% 0.1 formik asit ve inkübe 10 mcL ekleyin. Örnekleri 10 dakika boyunca sonikasyon süpernatantı toplamak ve adım 6.13 kaydedilir süpernatant ile birleştirmek. 7. Peptid özler Mikro tuzsuzlaştırma Üretici talimatlarına göre PepClean C-18 Spin Kolonlar (ThermoFisher) yardımı ile peptid özleri amonyum bikarbonat ve diğer tuzlar çıkarın. Zehir peptidler 20 mcL% 70 asetonitril ile iki kez, 1 saat ve tekrar süspansiyon için Centrivap Konsantratörü santrifüj kuru örnekleri buharlaşmasıMS analizi için 10 mcL% 0.1 formik asite peptidler. 8. HPLC-coupled kütle spektrometresi tarafından Protein tanımlama PS-DVB Pepswift yekpare bir sütun (Dionex)% 0.2 formik asit peptid karışımı 40 dakika boyunca yüksek bir performans likid kromatografi (HPLC), doğrusal bir 2-50% asetonitril degrade kullanarak ayrı ayrı 5 mcL, bir Nanospray akuple I ucunda 400 nL / dak akış hızında bir iyon tuzağı kütle spektrometresi (LÖA Deca XP Max, Thermo Fisher Scientific) üzerine kaynağıdır. 1400 m / z ve dinamik bir dışlama ile CID MS2 sıralaması için izole edilmesi için 3 en yoğun iyon doruklarına izin – 400 arasında peptid MS1 sinyallerini algılar. Protein tanımlanması için bir statik alkillenmiş sistein modifikasyonu ve fosforilasyon için dinamik değişiklikler (serin, treonin, tirozin), methyla Sequest fare referans veritabanı arama (BioWorks yazılım, Thermo Fisher Scientific) ile peptid sonuçları analizğünü (histidin), oksidasyon (metionin), ADP-ribosylation (arginin) ve N-terminal asetilasyon. Muhafazakar eşleştirme ölçütleri (örneğin, proteinler, Xcorr vs Şarj Devlet filtresi geçen en az 2 peptidler içeren 2 AMU ve 1.00 parçası hoşgörü, peptid hoşgörü uygulayın [z = 1 / x = 1.5, z = 2 / x = 2.00, z = 3 / x = 2.50, z = 4 / x = 3.00 ve p <0.05) 5 ve elle emin protein tanımlanması için MS spektrumları incelemek bir olasılık. 9 – Temsilcisi Sonuçlar: Erkek ve kadın unexercised, fare iskelet kası (biceps brachii'nin) ayıklanır ve iki boyutlu harita 5 kas karşılaştırmalı proteom (Şekil 2), ilk seviye ayrılır. Bir kez yüksek çözünürlüklü dijital görüntüleme kullanılarak görüntülendi; her birinde yaklaşık 800 protein noktalar tespit edildi. Erkek proteom harita kullanarak bir temel olarak, birçok noktalar kadın proteom bolca değişim olduğu açıktır. Spot şiddetleri protein miktarları değişiklik önlemler (Şekil 3). Iki kat (yukarı ya da aşağı) 'den daha fazla değişim ve protein noktalar kimlikleri istatistiksel olarak anlamlı (p <0.05) n = 5 fare ile amino asit dizi analizi, sıvı kromatografisi-birleştiğinde kütle spektrometresi ile belirlenir. Bu sonuçlar göstermektedir ki kadın şeker enerji metabolizması, enzimler, kreatin kinaz enzim (CK) izoformları, kasları farklı bir enerji arz sistemi bir bolluk azalma göstermektedir. Insan ve hayvanların, hem de dinlenme ve aşağıdaki egzersiz 9,10 daha yüksek erkek serum CK düzeyleri ekran, ancak serum CK düzeyleri mutlaka 11,12 myofibrillar kesinti miktarı ile ilişkili değildir. Bu cinsiyet dimorfizm fare biceps brachii'nin kas CK hücresel bolluk içinde bir roman finding5 ve fizyolojik olarak farklı serum CK düzeyleri cevap verebilirsiniz. Şekiller: g1.jpg "/> Şekil 1 karşılaştırmalı proteomik protokol genel bir şematik. Numunesinin analiz; ve protein kimlik numune hazırlama protokolü üç gruba ayrılmıştır; Genel protokol durmadan yürütülmektedir, en iyi sonuçları aldı olmasına rağmen protokolleri bu üç grubun her uçları, aynı zamanda makul bir duraklatma yerlerdir. Şekil 2 dişi fare pazı brachii'nin protein Karşılaştırma erkek pazı brachii'nin aynı noktalar (yeşil çevrelerin o) noktalar. Kadınlarda iki kat daha büyük ya da eşit artış Spotlar daire kırmızı (o) ve iki katına eşit veya daha az düştüğü o mavi (o) daire bulunmaktadır. Şekil 3 Jel Spot Yoğunluk Analizi: X-ekseni, kadınegzersiz öncesi (kontrol, n = 5), Y-ekseni, 0 sa bir zaman noktasında grup maçı kadın tek (n = 5). Regresyon doğrusu: korelasyon katsayısı = 0,919; eğim = 0,976; önünü = -0,0293. – Kırmızı çizgi mavi çizginin üstünde ve altında iki kat Spotlar + / daha fazla değiştirebilir.