Summary

Transretinal ERG Recordings aus Maus-Retina: Stäbchen und Zapfen Photomorphosen

Published: March 14, 2012
doi:

Summary

Wir beschreiben eine relativ einfache Methode der transretinal Elektroretinogramm (ERG) Aufnahmen für den Erhalt von Stäbchen und Zapfen Photomorphosen aus intakten Maus Netzhaut. Dieser Ansatz nutzt die Block der synaptischen Übertragung von Photorezeptoren ihre Lichtantworten isolieren und speichert sie über das Feld über den Elektroden isoliert flachen montiert Netzhaut zu liegen.

Abstract

Es gibt zwei unterschiedliche Klassen von bildgebenden Photorezeptoren in der Retina von Wirbeltieren: Stäbchen und Zapfen. Stäbchen sind in der Lage, einzelne Photonen des Lichts erkennen, während Kegel kontinuierlich arbeiten unter rasch wechselnden hellen Lichtverhältnissen. Die Absorption von Licht durch Stab-und Kegel-spezifischen visuellen Pigmente in den äußeren Segmenten der Photorezeptoren löst eine Phototransduktionskaskade, die sich letztendlich in der Schließung des zyklisch Nukleotid-gesteuerten Kanäle auf der Plasmamembran und Zelle Hyperpolarisation. Dieses Licht-induzierte Veränderung der Membran aktuellen und potenziellen kann als Photoresponse registriert werden, entweder durch klassische Saugelektrode Aufnahmetechnik 1,2 oder durch Aufnahmen transretinal Elektroretinogramm (ERG) von isolierten Netzhaut mit pharmakologisch blockiert postsynaptische Antwort Komponenten 3-5. Das letztere Verfahren kann Arzneimittel-zugänglich dauerhafte Aufzeichnungen aus der Maus Photorezeptoren und ist besonders nützlich für die Herstellung von stabilen Photomorphosen from die knappen und fragilen Maus Kegel. Im Falle von Kegeln kann solche Experimente sowohl in dunkeladaptierten folgenden Bedingungen und intensive Beleuchtung, die im wesentlichen alle bleicht Sehpigment durchgeführt werden, um den Prozess der Membran Photoempfindlichkeit Rückgewinnung beim Dunkeladaptation 6,7 überwachen. In diesem Video zeigen wir, wie Stab-und M / L-Kegel-driven transretinal Aufnahmen aus dunkeladaptierten Maus Netzhaut führen. Rod Aufnahmen durchgeführt werden, indem Retina von Wildtyp (C57Bl / 6) Mäusen. Mäuse, die Stange fehlt Signalisierung 8. Der Einfachheit halber wird Kegels Aufnahmen aus genetisch modifizierten Stabsatzes Transducin α-Untereinheit-Knockout (- / – Tα) erhalten werden

Protocol

1. Herstellung von Elektroden Bereiten Glaselektroden. Wiegen Sie 120 mg Agar und mischen Sie es in 10 ml destilliertem Wasser (letzte Konzentration Agar 1,2%). Schmelzen Sie die Agar-Lösung im heißen Wasserbad. Füllen Sie Glaskapillaren (wir benutzen Word-Presision Instruments TW100-4 Kapillaren mit folgenden Abmessungen: Länge = 100 mm, Da / Di = 1/0.75 mm und innere Volumen = 44 mL) mit dem Agar-Lösung mit Kunststoff-Spritze. Verfestigen des Agar bei Raumtemperatur für 10 min. Somit können bis zu ca…

Discussion

Die Methode der Stab-und Kegel-driven transretinal ERG Aufnahmen oben beschrieben wird immer ein mächtiges Werkzeug zur Untersuchung der Funktion der Maus Photorezeptoren sowohl in Wildtyp-und genetisch veränderte Tiere. Zusätzlich zu dem einfachen Charakterisierung von basischen Photoantwort Eigenschaften bietet diese einfache Technik große Resonanz Stabilität bei langen Experimente schließen zu erhalten Retina-Präparaten durchgeführt. Sowohl dunkeladaptierten Stange maximale Reaktion Amplitude und Lichtempfind…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Unterstützt von Career Development Award von der Forschung zur Erblindung zu verhindern, NIH Zuschüsse EY19312 und EY19543 (VJK), sowie durch nicht zweckgebundenen Zuschuss von Forschung zur Erblindung und EY02687 (Klinik für Augenheilkunde und Visual Sciences an der Washington University) zu verhindern.

Materials

Material Name Type Company Catalogue Number Comment
DL-AP-4   TOCRIS bioscience 0101  
All other reagents   Sigma-Aldrich    
Glass capillaries   World Precision Instruments TW100-4 For making electrodes
Filter paper HARG Millipore HABG01300  
Photometer   UDT Instruments S350 For light calibration
Radiometric silicon sensor   UDT Instruments 221 For light calibration
Anti-vibration table   Technical Manufacturing Corporation TMC 78-239-02R, TMC63-26012-01 To minimize mechanical noise
Air compressor Panther P 15TC   Werther International P 15TC Connected to anti-vibration table
Stereomicroscope   LEICA MZ9.5 For mouse eye dissection
Infrared image converters   B.E.Meyers ProwlerTM Bound to stereomicroscope
Differential amplifier
DP-311
  Warner Instruments DP-311  
Axon Digidata 1440A Digitizer   Molecular Devices 1440A  
Dual Channel 8-pole Filter   KROHN-HITE Corporation 3382  
Ceramic resistor   TE Connectivity CGS SBCHE618RJ For reheating the perfusion solution
Thermocouple T Physitemp Instruments IT-18  
Temperature monitor   Omega DPi32 Connected to thermocouple
LED 505 nm   TT Electronics/ Optek Technology Digi-key P/N 365-1185-ND To apply test flashes/bleaching light
Cautery pen   Bovie AA25 For marking the dorsal part of the mouse eyeball
pCLAMP 10 Electrophysiology Data Acquisition and Analysis Software   Molecular Devices    

References

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Cite This Article
Kolesnikov, A. V., Kefalov, V. J. Transretinal ERG Recordings from Mouse Retina: Rod and Cone Photoresponses. J. Vis. Exp. (61), e3424, doi:10.3791/3424 (2012).

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