إنتاج وناقلات Titering الغدة المؤتلف المرتبطة الفيروسية
Summary
الغدة المؤتلف المرتبطة بفيروس (rAAVs) ناقلات أصبحت ذات قيمة متزايدة لل<em> في الجسم الحي</em> دراسات في الحيوانات. نحن تصف كيف يمكن أن تنتج rAAVs في المختبر ، وكيف يمكن titered هذه النواقل لإعطاء قراءة دقيقة لعدد من الجزيئات المعدية المنتجة.
Abstract
في السنوات الأخيرة الغدة المؤتلف المرتبطة النواقل الفيروسية (AAV) أصبحت ذات قيمة متزايدة لفي الدراسات المجراة على الحيوانات ، وهنا أيضا يجري اختباره حاليا في تجارب اكلينيكية على البشر. من النوع البري AAV عضو غير ممرضة للأسرة وparvoviridae بطبيعتها النسخ التي تعاني من نقص. جعلت ملف تنبيغ واسع ، استجابة مناعية منخفضة وكذلك التعبير التحوير قوية ومستمرة مع هذه الناقلة حققت لهم أداة شعبية وتنوعا لفي المختبر والمجراة في توصيل الجينات. rAAVs يمكن بسهولة وبثمن بخس المنتجة في المختبرات ، واستنادا الى البيانات الشخصية للسلامتهم مواتية ، وتعطى عادة لتصنيف السلامة منخفضة. هنا ، نحن تصف طريقة لانتاج وtitering من rAAVs خيالية تحتوي على البروتينات قفيصة كلا AAV1 وAAV2. استخدام هذه الناقلات ما يسمى خيالية يجمع بين فوائد كل من الأنماط المصلية الأبوية مثل الأسهم عيارات عالية (AAV1) وتنقيةالتي تقارب اللوني (AAV2). هذه الأنماط المصلية AAV هي أفضل درس لجميع الأنماط المصلية AAV ، ويكون فرديا نمط العدوى واسعة. ينبغي للناقلات خيالية وصفها هنا لديهم خصائص المعدية وAAV1 AAV2 وبالتالي يمكن توقع أن تصيب مجموعة كبيرة من الأنسجة ، بما في ذلك الخلايا العصبية ، الهيكل العظمي والعضلات والبنكرياس والكلى وغيرها. يعتقد أن الأسلوب أسلوب الموصوفة هنا يستخدم الهيبارين تنقية العمود ، لإعطاء أعلى عيار الفيروسية وإعداد أنظف من وسائل تنقية الفيروسية الأخرى ، مثل الطرد المركزي من خلال التدرج كلوريد السيزيوم. بالإضافة إلى ذلك ، وصف لنا كيف يمكن أن تكون هذه الناقلة بسرعة وسهولة titered لإعطاء قراءة دقيقة لعدد من الجزيئات المعدية المنتجة.
Protocol
Discussion
ناقلات rAAV أصبحت ذات قيمة متزايدة لفي الدراسات المجراة على الحيوانات. هنا ، وقد وصفت لدينا بروتوكول بسيطة وغير مكلفة لrAAVs المنتجة ، والتي قد تسهل تطبيق على نطاق واسع من هذه النواقل مفيدة عن طريق تجنب الاستعانة بمصادر خارجية مكلفة لإنتاج فيروس للشركات. البروتوكول (على أساس مرجعية 1) يصف إنتاج النواقل rAAV1 / 2 التي تحتوي على البروتينات قفيصة خيالية من كلا الوالدين المصليين في نسب متساوية 4. تنقية ناقلات rAAV ملزمة لأعمدة الهيبارين يعتمد على التعبير عن AAV2 البروتينات قفيصة ، ولكن يمكن دمجها مع غيرها من الأنماط المصلية من AAV1 الواردة هنا. بالإضافة إلى ذلك ، تم الإبلاغ عن AAV6 ربط الهيبارين ، على الرغم من تقارب مع انخفاض ، ويحتمل أن يطهر الهيبارين مع الأعمدة باستخدام هذا الإجراء 5،6. وتجدر الإشارة إلى أنه مع ذلك ، أن الأنماط المصلية الأخرى سوف تتطلب تركيزات مختلفة من كلوريد الصوديوم لشطف العمود 5،7 الهيبارين.
وقد تبين التغليف الجينوم rAAV أن أمثل بين 4.1 و 4.9 كيلو بايت مع انخفاض حاد في كفاءة التعبئة تصل إلى 5.2 كيلو بايت 8. ويمكن اعتبار هذا الحد التغليف أكبر عيوب النظام rAAV ، وعادة ما يتحقق منذ الخلية نوع معين من التنظيم من قبل رابطة الدول المستقلة التعبير التحوير كبيرة تعمل العناصر التي لا يمكن استيعابها داخل جزيئات AAV الصغيرة. للتغلب على دفعات عيار منخفضة ، مثل تلك الناجمة عن محاولة مجموعة الجينات التي هي قريبة إلى حد التعبئة AAV نحن الجمع بين دفعات منفصلة تتركز الفيروسية إلى 250 ميكروليتر في الدفعة 500 one ميكرولتر ، بدلا من إضافة برنامج تلفزيوني على النحو المبين في الخطوة 6.3. ويمكن تحقيق موثوق الخلية من نوع محدد من الفئران تنبيغ لجنة المساواة العرقية الجمع بين السائق وأشرطة rAAV الشرطي (انظر أدناه) لتجنب تمتد حدود التعبئة والتغليف.
من الملاحظة ، في حين أن هذا البروتوكول محاولات لتوفير سهلة المتابعة تعليمات لإنتاج طن عاليةمعبر rAAV ، فإنه يتطلب وجود البروتين قفيصة AAV2 شاردات لتنقية اللوني التي تقارب الهيبارين. يجب تنقيتها من الأنماط المصلية الأخرى AAV2 باستخدام إجراءات بديلة 9. ميزة واحدة من العمود تنقية الهيبارين يعتقد أن انتاج ناقلات AAV التي أكبر معدل العدوى من تلك المنتجة باستخدام التدرج كلوريد السيزيوم 10. ومع ذلك ، هناك أيضا بعض العيوب لهذا الأسلوب. على سبيل المثال ، قد البروتينات الأخرى التي تربط الهيبارين أيضا أن تكون موجودة في المخزون الفيروسية المنقى. في حين يمكن أن تؤثر على النواقل tropism – الهيبارين تنقيته من عيار 10 ناقلات ، نهجنا خصيصا لاستهداف إما 20 أو استثارية الخلايا العصبية المثبطة (الشكل 2) توظف لجنة المساواة العرقية التي يسببها تفعيل التعبير التحوير AAV بوساطة وعيار مستقلة. بديل لتنقية العمود الهيبارين هو استخدام لكثافة iodixanol التدرج ، والتي تنتج أعلى عيار الفيروسية وإعداد أنقى من استخدامكلوريد السيزيوم الانحدار 10. ويمكن أيضا أن تكون هذه الطريقة جنبا إلى جنب مع عمود تنقية الهيبارين لانتاج ناقلات أكبر من 99 ٪ نقية 11. لذلك ، النظر بعناية الاحتياجات التي يتعين اتخاذها من قبل الجماعات الفردية على النحو الذي الفيروسية الأسلوب هو الأفضل لتنقية تطبيقها المصب معينة.
المشكلة الأكثر شيوعا المرتبطة بهذا البروتوكول هو عيار الفيروسية منخفضة. ويمكن في تجربتنا هذه عادة أن تعزى إلى انخفاض كفاءة ترنسفكأيشن ، أو شطف من الفيروس من الأعمدة الهيبارين. وينبغي أن تكون جميع المواد ترنسفكأيشن في درجة حرارة الغرفة قبل ترنسفكأيشن ، ويجب أن يتم تنفيذ transfections اختبار للعثور على أفضل الظروف في كل مختبر. طرق أخرى لنقل العدوى ، مثل lipofectamine ، وكفاءة عالية ، ولكن يمكن أن تكون باهظة التكلفة. بالإضافة إلى ذلك ، التركيز ودرجة الحموضة من الحلول العمود شطف الهيبارين هو أمر حاسم لشطف كاملة virions من الأعمدة witho الهيبارينالتحرير الضرر. نقطة أخرى مهمة هي أن الخلايا التعبئة والتغليف يجب أن تلتزم أيضا إلى السطح من الأطباق زراعة الأنسجة. إذا كانت الخلايا فصل في مرحلة ما أثناء إجراء ينصح لإنهاء التجربة وتذويب قارورة جديدة من الخلايا.
ويتحقق بسهولة السيطرة المكانية والزمانية التعبير التحوير في القوارض من خلال استهداف تشريحية دقيقة والمرحلة التنموية للحيوان. وقد أظهرت كفاءة نقل الجينات AAV بوساطة 12،13 في الرحم. الكبار في الدماغ ، يمكن تعديلها المنطقة المصابة مع جزيئات rAAV بعد حقن صغيرة جدا من التجسيمي المناطق المستهدفة ، إلى مناطق أكبر من ذلك بكثير ، ليس فقط بسبب التغيرات في عيار الفيروسية ولكن أيضا عن طريق تغيير معالم الحقن. وتشمل هذه حجم وسرعة الحقن وإدراج مانيتول البوليول مع تعليق الفيروس 14. ويمكن أيضا أن تستخدم لمانيتول تعزيز العدوى من مجموعة متنوعة من الأنسجة بعد الحقن rAAV النظامية 15 </ سوب>.
قدرة التعبئة والتغليف من rAAV (حوالي 4.7 كيلوبايت) وربما كان أهم عامل يحد من حيث الجينات التي يمكن التعبير عن هذه النواقل الفيروسية. ومع ذلك ، فقد أظهرت الدراسات الحديثة أنه يمكن التغلب على هذه الجينات جزئيا تقسيم أكبر أو أشرطة التعبير إلى نواقل rAAV منفصلة وإدخال تسلسل سد ، وبدء التعبير الجيني عندما تصيب virions نفس الخلية 16. ويمكن أيضا مستويات التعبير عن الجينات التي تحملها ناقلات rAAV ستتعزز إلى حد كبير باستخدام الذاتي مجانية ناقلات rAAV 17. حقن التجسيمي ناقلات rAAV يوفر السريع ، وطريقة رخيصة وقوية لحمل الجينات في المنطقة بطريقة محددة. ويمكن في تركيبة مع 2 استراتيجيات الجيل الثاني تدخل الحمض النووي الريبي أيضا 18 rAAVs تستعمل لمنطقة محددة الجينات نهدم. ويمكن الجمع بين لجنة المساواة العرقية ، rAAVs مع الفئران المعدلة وراثيا أو خلية من نوع المروجين محددة لتحقيق الدوائر ونوع الخليةمحددة التعبير الجيني ، مما يتيح التلاعب الجيني لقرار مكانية عالية 2،19-21 ، بينما rAAVs مع تركيب نظام مثل تيت ويضيف السيطرة الزمنية على الفيروس بوساطة 22،23 التعبير الجيني ، وهذه الأمثلة توضح إمكانات هائلة اندماجي من هذه النواقل و ويتوقع حدوث زيادة سريعة في rAAV الدراسات المستندة على مدى السنوات القادمة.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Materials
| Name of reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| Amicon Ultra centrifugal filters | Millipore | UFC810024 | 100,000 MWCO |
| Benzonase nuclease | Sigma-Aldrich | E1014 | |
| Dulbeco’s modified Eagle medium (DMEM) | Invitrogen | 10567014 | Supplement with 10% FCS and 10 units/ml penicillin/100 μg/ml streptomycin |
| Hek293 cells | American type culture collection | CRL-1573 | Use at passage less than 30 |
| HEPES buffered saline | Sigma-Aldrich | 51558 | |
| HiTrap Heparin cartridge | Sigma-Aldrich | 54836 | |
| Iscove’s modified Dulbecco’s medium | Invitrogen | 12440-053 | Supplement with 5% FCS |
| Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | D5670 | Make fresh solution for each batch |
| 15 cm Tissue culture dishes | Fisher Scientific | 157150 | |
| Stbl2 competent cells | Invitrogen | 10268-019 | |
| Virkon solution | Fisher Scientific | NC9821357 | Leave to disinfect overnight before discarding to drain |
Table 1. Specific reagents required for protocol
References
- Klugmann, M. AAV-mediated hippocampal expression of short and long Homer 1 proteins differentially affect cognition and seizure activity in adult rats. Molecular and Cellular Neurosciences. 28, 347-360 (2005).
- Murray, A. J. Parvalbumin-positive CA1 interneurons are required for spatial working but not for reference memory. Nature Neuroscience. 14, 297-299 (2011).
- Hippenmeyer, S. A developmental switch in the response of DRG neurons to ETS transcription factor signaling. PLoS Biology. 3, e159-e159 (2005).
- Hauck, B. Generation and characterization of chimeric recombinant AAV vectors. Molecular Therapy. 7, 419-425 (2003).
- Halbert, C. L., Allen, J. M., Miller, A. Adeno-associated virus type 6 (AAV6) vectors mediate efficient transduction of airway epithelial cells in mouse lungs compared to that of AAV2 vectors. Journal of Virology. 75, 6615-6615 (2001).
- Blankinship, M. J. Efficient transduction of skeletal muscle using vectors based on adeno-associated virus serotype 6. Molecular Therapy. 10, 671-678 (2004).
- Wu, Z. Single amino acid changes can influence titer, heparin binding, and tissue tropism in different adeno-associated virus serotypes. Journal of Virology. 80, 11393-11397 (2006).
- Dong, J. Y., Fan, P. D., Frizzell, R. A. Quantitative analysis of the packaging capacity of recombinant adeno-associated virus. Human gene therapy. 7, 2101-2112 (1996).
- Zolotukhin, S. Production and purification of serotype 1, 2, and 5 recombinant adeno-associated viral vectors. Methods. 1, 158-167 (2002).
- Burova, E., Loffe, E. Chromatographic purification of recombinant adenoviral and adeno-associated viral vectors: methods and implications. Gene Therapy. 12, 5-17 (2005).
- Zolotukhin, S. Recombinant adeno-associated virus purification using novel methods improves infectious titer and yield. Gene Therapy. 6, 973-985 (1999).
- Bilbao, R. Patterns of gene expression from in utero delivery of adenoviral-associated vector serotype 1. Human Gene Therapy. 16, 678-684 (2005).
- Pilpel, N. reproducible transduction of select forebrain regions by targeted recombinant virus injection into the neonatal mouse brain. Journal of Neuroscience Methods. 182, 55-63 (2009).
- Mastakov, M. Y. Combined injection of rAAV with mannitol enhances gene expression in the rat brain. Molecular Therapy. 3, 225-232 (2001).
- Fu, H. Self-complementary adeno-associated virus serotype 2 vector: global distribution and broad dispersion of AAV-mediated transgene expression in mouse brain. Molecular Therapy. 8, 911-917 (2003).
- Ghosh, A., Yue, Y., Duan, D. Efficient Transgene Reconstitution with Hybrid Dual AAV Vectors Carrying the Minimized Bridging Sequences. Human Gene Therapy. 22, 77-83 (2011).
- McCarty, D. M. Self-complementary AAV vectors; advances and applications. Molecular Therapy. 16, 1648-1656 (2008).
- Georgiadis, A. AAV-mediated knockdown of peripherin-2 in vivo using miRNA-based hairpins. Gene Therapy. 17, 486-493 (2010).
- Atasoy, D. A FLEX switch targets Channelrhodopsin-2 to multiple cell types for imaging and long-range circuit mapping. The Journal of Neuroscience. 28, 7025-7030 (2008).
- Guggenhuber, S. AAV Vector-Mediated Overexpression of CB1 Cannabinoid Receptor in Pyramidal Neurons of the Hippocampus Protects against Seizure-Induced Excitoxicity. PLoS One. 5, e15707-e15707 (2010).
- Lawlor, P. A. Efficient gene delivery and selective transduction of glial cells in the mammalian brain by AAV serotypes isolated from nonhuman primates. Molecular therapy : the journal of the American Society of Gene Therapy. 17, 1692-1702 (2009).
- Chtarto, A. Tetracycline-inducible transgene expression mediated by a single AAV vector. Gene Therapy. 10, 84-94 (2003).
- Han, Y. Lack of humoral immune response to the tetracycline (Tet) activator in rats injected intracranially with Tet-off rAAV vectors. Gene Therapy. 17, 616-625 (2010).
