En afskaerme mikrofluid enhed til undersøgelse af kræft stamceller migration er beskrevet. Denne hidtil ukendte platform skaber en levedygtig cellulære mikromiljø og muliggør mikroskopisk visualisering af levende celler bevægelse. Stærkt motile kræftceller isoleres for at studere molekylære mekanismer for aggressiv infiltration og potentielt føre til mere effektive fremtidige behandlinger.
I de seneste 40 år investeret i USA over 200 milliarder dollars på kræftforskning, hvilket resulterer i kun en 5% nedgang i dødelighed. En væsentlig hindring for at forbedre patienternes resultater er dårlig forståelse af mekanismer bag cellulær migration er forbundet med aggressiv cancer celle invasion, metastase og terapeutiske modstand 1. Glioblastoma multiforme (GBM), den mest udbredte primære maligne voksne hjernetumor 2 eksemplificerer dette problem. Trods standard kirurgi, stråling og kemoterapi, er tålmodig median overlevelse kun femten måneder, på grund af aggressiv GBM infiltration i tilstødende hjerne og hurtig cancertilbagefald 2. Samspillet mellem afvigende celle vandrende mekanismer og tumormikromiljøet sandsynligvis skelne kræft fra normale celler 3. Derfor forbedrer terapeutiske tilgange til GBM kræver en bedre forståelse af kræft cellemigration mekanismer. Nyere undersøgelser tyder på thata lille subpopulation af celler i GBM, kan hjernetumor stamcelle (BTSC), være ansvarlig for terapeutisk modstand og gentagelse. Mekanismer, der ligger BTSC vandrende kapacitet er først begyndt at blive karakteriseret 1,4.
På grund af en begrænsning i visuel inspektion og geometriske manipulation, konventionelle migration assays 5 er begrænset til kvantificering samlede cellepopulationer. I modsætning hertil tillader mikrofluidenheder enkelt celle analyse på grund af kompatibilitet med moderne mikroskopi og kontrol over mikro-miljø 6-9.
Vi præsenterer en metode til detaljeret karakterisering af BTSC migration ved hjælp af afskaerme mikrofluidenheder. Disse PDMS-udstyr efter kaste vævskultur miljø i tre forbundne rum: såning kammer, der modtager kammer og bygge bro microchannels. Vi skræddersyet enheden, således at begge kamre har tilstrækkelige medier til at understøtte levedygtige BTSC til 4-5 days uden medier udveksling. Meget mobile BTSCs oprindeligt indført i seeding kammeret er isoleret efter migrering dog bygge bro microchannels til den parallelle modtagende kammer. Denne migrering simulerer cancer cellulære spredning gennem mellemrummene i hjernen. Fase levende billeder af cellemorfologi under migration registreres over flere dage. Stærkt vandrende BTSC kan derfor være isoleret, recultured og analyseret yderligere.
Afskaerme mikrofluidik kan være en alsidig platform til at studere vandrende adfærd BTSCs og andre kræft stamceller. Ved at kombinere gradient generatorer, væskehåndtering, mikro-elektroder og andre mikrofluid moduler, kan disse enheder også anvendes til drug screening og sygdomsdiagnose 6. Isolering af en aggressiv underpopulation af vandrende celler vil muliggøre studier af underliggende molekylære mekanismer.
Den mikrofluid enhed og image-optagelse teknik præsenteres her giver en visuel karakterisering af cellemorfologi under migration. Sammenlignet med de eksisterende konventionelle metoder, træk den mikrofluid platform fordele ved omkostningseffektivitet, høj kapacitet og design fleksibilitet. Den præsenterede mikroskopisk visualisering system tillader undersøgelse og registrering af langvarig levende cellemigrering. Linsen-motoriseret funktion gør det muligt at spore flere migrationsveje i en høj billed-opløsning uden at forstyrre prøven.
Under samling af indretningen, er PDMS stempel ikke-permanent bundet til dækglas til hjælp for PDL belægning (trin 3.4). Det er afgørende for at opnå en god tætning for succes i denne protokol. Kontaminering indført fra enheden fabrikation, såsom luftboble i stempel eller støv / affald på substratet, kan true binding og resulterer i det væsker. Derfor TREATIng enheden i et støvfrit måde er det vigtigt at undgå funktionssvigt. Forud for PDL-coating, de dækglas er salpetersyre behandles, og den PDL opløsning centrifugeres for at fjerne støv / affald. Vi finder Scotch tape, alkohol skyl, og vandbad meget nyttige i at fjerne støv / snavs fra PDMS stempel, hvis en ren værelse ikke er tilgængelig. Efter PDMS stempel gør kontakt med dækglas, letter trykke stemplet forsigtigt med en pincet tætningen.
BTSCs kan beriges fra humane operationsstuen prøver via kugle kultur i stamcellemedium, svarende til dyrkning af normale neurale stamceller 10. BTSCs beriget på denne måde viser stamcelle-lignende egenskaber, såsom ekspression af stamceller markører (CD133, nestin), differentiering til flere neurale slægter (glia og neuronal), og tumorinitiering i en orthotopisk immundefekt musemodel med så få som 100 celler 18. Selv om nogle debat eksisterer omkring renskation og vedligeholdelse af BTSCs 1, 19-21, kugle-dyrkede BTSCs bedre opretholde fænotype og genotype af den parentale tumor 22-24.
Den underinddelte space efterligner den fysiologiske miljø for cellemigrering. I vores enhed, udviser BTSC en stærk kapacitet til migration gennem en størrelsesselektiv tvungne rum ved at regulere cellulær morfologi. Vores karakterisering af cellens morfologiske ændringer indikerer mode-transformationer i en seks trins sekvens, som kan modellere en eventuel ny detaljeret beskrivelse af BTSC invasion af tilstødende hjerne. I tidlige stadier, får cellerne en betydelig mængde af polaritet og generere klæbende fremspring til effektivt at forankre sig selv inde i mikrokanalplade. Når cellen belægning i mikrokanalen er etableret, det konverterer til en cruising-tilstand og fastholder denne tilstand for hele rejsen gennem en mikrokanalplade. På dette stadium opretholder BTSC høj motilitet og ensartet retning, men bevare energi. Iterestingly fremgår det, at en mikrokanal er begrænset til én cruising celle ad gangen, således at når en enkelt celle fortsætter til denne fase, andre celler tilbagetrækning fra mikrokanalen. Denne mekanisme sandsynligvis sikrer effektiviteten af tumor spredning og forhindrer overforbrug af næringsstoffer i mikrokanalplade. Efter at have udfyldt migration over den mikrokanalen, genvinder en celle sin tilbøjelighed til multidirectional fremspring og yderligere efterforskning for invasion mål eller nye migrationsveje. Den afskaerme mikrofluid enhed tilbyder en roman in vitro middel til at skabe et mikromiljø for at studere BTSC infiltration af hjerneparenkymet.
Denne metode kan let tilpasses til studiet af cancer stamcelle (CSC) og vandrende cellelinier afledt fra andre tumortyper. Dyrkning af celler i mikrofluid anordning kan udføres i enhver moderne biologi laboratorium, der er udstyret med en inkubator og vævskultur ekspertise. Udstyret med en su-8 master, PDMSstøbning og enhedens samling er mulige med nogle grundlæggende uddannelse i blød litografi. Desuden kan denne platform også udvides til andre applikationer med integration af andre funktionelle moduler såsom gradient mixer, overflade mønster, flydende kontrol og mikroelektrode.
The authors have nothing to disclose.
PAC er delvist støttet af en NIH T32 tilskud til University of Wisconsin Stem Cell Training Program (PA Clark). JSK blev delvist støttet af Headrush Brain Tumor Research Professorship, Roger Loff Memorial GBM Research Fund, og UW Foundation / Neurokirurgi Brain Tumor Research og Education Fund. Jcw og YH er delvist støttet af NIH tilskud NIBIB 1R01EB009103-01.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
Dulbecco’s modified eagle’s medium (DMEM), high glucose | Gibco / Invitrogen | 11965 | Brain tumor stem cell (BTSC) culture supplies |
Ham’s F12 | Gibco / Invitrogen | 31765 | Brain tumor stem cell (BTSC) culture supplies |
B27 supplement minus vitamin A | Gibco / Invitrogen | 12587-010 | Brain tumor stem cell (BTSC) culture supplies |
Antibiotic-Antimycotic (PSA) | Gibco / Invitrogen | 15240 | Brain tumor stem cell (BTSC) culture supplies |
Epidermal Growth Factor (EGF), human recombinant | Gibco / Invitrogen | PHG0313 | Brain tumor stem cell (BTSC) culture supplies |
basic Fibroblast Growth Factor (bFGF) , human recombinant | Gibco / Invitrogen | PHG0021 | Brain tumor stem cell (BTSC) culture supplies |
Heparin sodium salt, from porcine intestinal mucosa | Sigma | H1027-250KU | Brain tumor stem cell (BTSC) culture supplies |
Laminin (natural mouse) | Gibco / Invitrogen | 23017-015 | Brain tumor stem cell (BTSC) culture supplies |
Accutase | Millipore | SCR005 | Brain tumor stem cell (BTSC) culture supplies |
Stem cell medium |
|
||
Basic Fibroblast Growth Factor (bFGF)/ Heparin |
|
||
Epidermal Growth Factor (EGF) |
|
||
Heparin |
|
||
su-8 photoresist | MicroChem | ||
Silicon handle wafer | WRS Materials | 3P01-5SSP-INV | |
trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silane | Sigma-Aldrich | 448931 | |
PDMS Sylgard 184 | Dow Corning | ||
laminin | BD Bioscience | 50 μg/ml in PBS buffer for the final concentration | |
Biostation IM | Nikon instruments |