Evaluation of Cancer Stem Cell Migration Mit Abschottung Mikrofluidiksysteme und Live Cell Imaging

Ein. BTSC die Zelldissoziationslösung BTSCs sind aus bereits bestehenden Kulturen in serumfreiem Medium als Stammzelle Neurospheres gezüchtet abgeleitet. Kultur von denen bisher 10, 11 beschrieben. Bereiten Zellsuspension aus BTSC-derived Neurosphären. BTSC-derived Neurospheres werden in einem 15 ml konischen Röhrchen gesammelt und zentrifugiert bei 900 UpM für 5 Minuten. Schnellere Zentrifugation Scher-und / oder Schäden an der Neurosphären. Überstand wird abgesaugt und Neurosphäre Kultur wird in 0,5 ml vorgewärmtes Accutase resuspendiert. Diese Lösung wird für 5-10 Minuten bei 37 ° C ermöglicht die Neurospheres zu lockern. Zellen werden mechanisch mit 10-20 sanften Schlägen eines P100 Pipette und dann 1,5 ml Stammzelle Medium zu den Zellen hinzugefügt, um die Accutase neutralisieren gestört. Die BTSCs werden dann bei 1300 UpM für 5 Minuten zentrifugiert, gewaschen und in 1 ml Medium Stammzelle. Eine 50 ul-Aliquot wird von den suspens entferntIon und in ein Mikrozentrifugenröhrchen platziert zur Zellzählung. 50 ul Trypanblau ist mit der Eppendorf-Röhrchen gegeben und die Suspension wird in einem Hämozytometer zur Zellzählung platziert. Wenn nach Zellzählung benötigt wird zusätzliches Stammzelle Medium zu der BTSC Suspension auf eine Zelldichte von 20.000 lebenden Zellen / ul Medium zu ergeben. 2. Herstellung von zweischichtigen su-8 Master und Formen von PDMS-Stempel (siehe Abbildung 1) Wir nutzen die optische Lithographie und weiche Lithographie su-8 Master-und PDMS-Stempel, die wesentlich für die Montage der Mikrofluidik-Geräte sind zu fabrizieren. Etwas anders als die Standard-Verfahren 12, ist unser su-8 Master aus zwei Schichten. Die 3-um-tall Mikrokanäle in der ersten / unteren Schicht früher im Prozess gegossen, während die 250-um-tall Säen und Aufnahmekammern in der zweiten / oberen Schicht sind. Um für die richtige Verbindung zwischen zwei Kultur Fächer (Mikrokanals und Kammern), haben die beiden Schichten, um genau in Position ausgerichtet werden. Allerdings sind Dicke und Deckkraft der zweiten Schicht groß genug, um die fiducial / optische Ausrichter der Zugriff auf einen der unten stehenden Funktionen zu blockieren. Hier gestalten wir die Masken mit Bezugsmarken der Ferne positioniert. Somit können diese Marker in der ersten Schicht selektiv abgeschirmt werden beim Spinnen der zweiten Schicht. Als Ergebnis werden beide Schichten von Merkmalen in einem Master hergestellt und bereit zum Formen in Basrelief der PDMS-Stempel. Design und bereiten zwei Photomasken. Eine Maske besteht aus zwei Bezugsmarkierungen und einer Anordnung von Mikrokanälen (400 um Länge und 10 bis 50 um Breite) für die erste Schicht. Eine weitere Maske aus Setzen und Aufnahmekammern (2 mm lang und 600 um Breite) für die zweite Schicht. Beide Masken in Illustrator (Adobe, Kalifornien) sind so konzipiert, auf Transparentfolien (Thin Metal Parts, Colorado), mit Isopropanol und luftgetrocknet gereinigt Laserdruck. Sprechen Sie die erste Schicht mitSU-8 Fotolack (MicroChem, Massachusetts) je nach Produkt-Handbuch von Lieferanten. Erstens Spin-Beschichtung der Handhabungswafer (WRS Materialien, Kalifornien) mit 3-Mikrometer dicke Photolack SU-8 (5), durch weiche Einbrennen gefolgt. Der Fotolack wird dann UV-belichtet und gehärtet mit der entsprechenden Maske in engem Kontakt, durch Einbrennen und Entwicklung verfolgt. Spin-Beschichtung der zweiten Schicht mit 250 um dicken SU-8 (2100). Um dicke Photoresist von Blockierung der Bezugsmarken von der ersten Schicht zu verhindern, decken wir diese Bereiche mit Tesafilm in vor Spin-Beschichtung der zweiten Schicht. Das Band wird dann um die Markierungen für die Ausrichtung Zweck offenbaren geschält. UV-Setzen der zweiten Schicht mit der zweiten Maske. Wobei die Ausrichtmarkierungen offenbart, ist es einfach, sie zu den in der zweiten Maske unter Verwendung von optischen Maskaligner auszurichten. Die zweite Schicht aus Fotolack wird dann UV-belichtet und gehärtet in enger berührungsfrei, gefolgt von Nachbrennen und Entwicklungsländer. </ Li> Anti-Stick-Beschichtung der Folge Meister. Zur Entfernung von ausgehärteten PDMS zu unterstützen, kann die SU-8-Master über Gasphasenabscheidung um der Oberfläche eine Antihaft-Typ Beschichtung silanisiert sein. Einfach in einen Exsikkator für mindestens eine Stunde, mit einigen Tropfen Trichlor (1H, 1H, 2H, 2H-Perfluoroctyl) silan Lösung unter Vakuum. Mold PDMS mit dem Master. Mix Prepolymer Basis und Heiler der PDMS Sylgard 184 (Dow Corning, Michigan) in Verhältnis 10:1 gründlich. Legen Sie sie in einem Exsikkator Vakuumentgasung, bis keine Luftblasen zu sehen ist. Die Mischung auf der Maske und entgast wieder, wenn neues Luftblase eingeführt wird. Aushärten der Form auf einer Ebene Kochplatte für 2 Stunden bei 90 C. Nach dem es auf Raumtemperatur abgekühlt, vorsichtig loslassen PDMS-Stempel. So werden Kultivierung Kanäle in PDMS graviert und fertig für die Montage des Geräts. Der Master ist wiederverwendbar für Formgebung, bis er geknackt wird oder abgenutzt. Die Antihaft-Beschichtung muss erneut durchgeführt werden, wenn die Klebrigkeit gewinnt. 3.Montage von Mikrofluidikvorrichtungen und Zellkultivierungsraum (Abbildung 2) Um Zellkulturen ist feature-gravierten PDMS-Stempel mit einem Deckglas an geschlossene Kanäle bilden. Ein-und Auslässe für das Laden der Kultur / Medien geschaffen. Unterdessen sind Bereinigung und andere Verfahren, um das Glassubstrat und PDMS-Stempel notwendig, um die Zelle-Kompatibilität zu gewährleisten. Machen Reservoirs durch die PDMS-Stempel mit Biopsie Locher. Wir wählen ihr Durchmesser bis 6 mm betragen. Diese Behälter dienen zwei Zwecken. Eine besteht darin, zusätzliche Nährstoffe für das Zellwachstum zu halten. Der andere ist für den Zugang der Pipette Be-und Vakuum-Aspiration. Weichen Sie die PDMS-Stempel in 70% Ethanol für 30 min und dann spülen Sie ihn mit de-ionisiertem Wasser für weitere 10 min. Der Zweck besteht darin, mögliche organische Reste während der Herstellung eingebracht, und unvernetzten PDMS Kontamination zu löschen. Weitere intensive und gründliche Reinigung Prozesse wie organische Extraktion 13 </sup> Und Soxhlet-Extraktion 14 wurden an anderer Stelle verwendet werden. Allerdings fanden wir es unnötig in BTSC Kultur. Sterilisieren PDMS-Stempel mit Autoklaven (121 ° C, 35 min). Dieser Schritt weiter vervollständigt die Vernetzung Reaktion PDMS. Ausgehend von diesem Schritt und bis Schritt 3,6, alle Verfahren werden in sterile Weise berücksichtigt. Die PDMS-Stempel wird dann auf einem Deckglas, die zuvor mit Poly-L-Lysin beschichtet ist festgelegt. 15-17 Die Vorrichtung wird dann mit Laminin durch Füllen des Kanals mit Laminin Lösung über Nacht bei 37 ° C beschichtet Laminin aus der Vorrichtung abgesaugt und die Vorrichtung mit Stammzelle Medium gewaschen. Legen Zellsuspension aus Schritt 1 in Stauseen und Kanäle. 11 ul von dissoziierten Zellen werden in einem Aussaat Reservoirs platziert. Vakuumaspiration wird verwendet, um Zellen in die Kammer zu zwingen Aussaat, wenn notwendig. Eine zusätzliche 7 ul Zellen werden die angrenzenden Aussaat Reservoirs platziert. Hinweis: Durchschnittliche Zelldichte beträgt 20.000 Zellen / ul Medien. Achterner fünf Minuten, die Aussaat und Empfangen Reservoirs sind mit den Medien überflutet. Legen Sie ein 0,5-1 mm vor autoklaviert PDMS Blatt auf. Der natürlich aufgetreten Oberflächenhaftung zwischen zwei PDMS Stück wird die Zellkultur dicht und bereit für den Transport, die Inkubation und mikroskopische Bildgebung. 4. Langfristige Zeitraffer-Aufnahmen des BTSC Migration mit BioStation IM (Nikon Instruments Inc, Melville, USA). Die Kombination Kamera, Software und Gründerzentrum alles in einer Box macht diese mikroskopische System ist es möglich, Bild Zellkultur ohne Störung für Tag. Darüber hinaus bewegt sich die einzigartige Motorkonstruktion die Objektivlinse und hält Probentisch stationär in der Punkt-zu besuchen Funktion. Dies macht es praktisch, Bild parallelen Experimenten und Track Zellbewegung in Hochdurchsatz-Assay. Pre-Gleichgewicht der Biostation IM für 45 Minuten, um die Temperatur, Feuchtigkeit und Luftzufuhr zu stabilisieren. Zusatz von mehreren Wasser-contained Gerichte in der Probenkammer wird verwendet, um richtige Luftfeuchtigkeit zu halten. Legen Sie die Zelle geschlossenes Gerät in den Probenraum des Mikroskops, und in der Mitte ist mit Mikro Pinzette. Stellen Sie den Fokus, Position-Punkte und Zeit-Punkte Biostation Software und starten Sie den Zeitraffer. 5. Repräsentative Ergebnisse: Beispiele für visuelle Inspektion und Charakterisierung von Krebs Zellmigration durch Verwendung einer mikrofluidischen Vorrichtung Abschottung sind in Abbildung 3 und 4 dargestellt. Die Zell-Linie ist BTSC. Mit unserem aktuellen Setup können Phasenbilder der Zellkultur kontinuierlich so lange wie 5 Tage (Abbildung 3) und so häufig wie alle 2 Sekunden (Abbildung 4) aufgezeichnet werden. Beyond 5 Tagen, müssen Kulturmedien für Nährstoff-Nachschub und Abfall entfernt ersetzt werden. Unser langfristiges Zeitraffer identifiziert eine revolvierende Sequenz von sechs Zellstadien während ihrer Migration auf die morphologischen Veränderungen. Wie Abb.trierte in Abbildung 3, beschreiben wir sie als (i) vor der Migration, (ii) die Einleitung, (iii) Pfad-Exploration, (iv) Kreuzfahrt, (v) destination-exloration und (vi) nach der Migration. In der Aufnahmekammer, bleiben spindelförmigen Zellen in Stufe (i) wie in bulk Tumoren, die wachsen können, dividieren und schrittweise Migration sind. Als sie den Mikrokanal Eingang nähern, gehen Sie ein paar Zellen zu inszenieren (ii), wenn sie sich ausdehnen und erzeugen Kleber Vorsprung. Nur einer von ihnen ist in der Lage, um den Eingang zu besetzen und gehen zu Stufe (iii), das die Migrationsrichtung erkunden. Sobald die Zelle bestimmt die Migrationsrichtung, geht er weiter zu Schritt (iv) zu kreuzen durch den Mikrokanal in einer stetigen und hoher Geschwindigkeit, die durch die gesamte Mikrokanal ausgeführt wird. Am Ende des Mikrokanals, Zelle geht zu Stufe (v), um den offenen Raum der Aufnahmekammer zu erforschen, und dann die Stufe (vi). In Mikrokanal migriert Strom überwiegend von blebbing Aktivität wie in 4 dargestellt erzeugt, ähnlich der amöboiden cell. Zelle blebbing und Membranverformung sind voll hier erfasst. Abbildung 1. Schematische Darstellung der Herstellung von mikrofluidischen Gerät. Der gesamte Prozess wird auf einem 3-Zoll-Silizium-Wafer durch eine modifizierte Technik der weichen Lithographie durchgeführt. 3-um-tall Mikrokanäle und Ausrichtmarken sind wie in der ersten Schicht enthält. Dann wurden 250 um dicke su-8 aufgeschleudert, während die Ausrichtmarkierungen mit Tesafilm bedeckt sind, so dass sie später zugänglich sein Aligners ohne Sicht-Blockierung durch dicke Photoresist maskieren. Somit kann Kammer bietet als die zweite Schicht hergestellt werden und exakt an der ersten Schicht ausgerichtet sind. PDMS-Stempel wird schließlich aus dem resultierenden Master geformt. Abbildung 2. Schematics des Gerätes Montage und Zellaussaat Prozess. Umgeben von PDMS und glass Deckplättchen wird das 3D Raum Kultivieren von Kammern, Sammelbehälter und Mikrokanälen besteht. Die Aussaat Kammer mit Zellkultur gefüllt, während die Aufnahmekammer anfänglich mit zellfreien Medien befüllt. Die Mikrokanäle, die zwischen ihnen herstellen bieten Zell Migration Weg von Aussaat Seite zu empfangenden Seite. Abbildung 3. BTSC Migration durch Mikrokanal. Obermaterial: Schnappschüsse von Zeitraffer zeigen eine einzelne Zelle (grün markiert) wandert über 400 um von der Aussaat Seite der empfangenden Seite. Die gesamte Fahrt dauert etwa 2 Tage, an denen eine Sequenz von Zellen morphologische Veränderungen. Der Maßstab beträgt 40 um. Untere: eine Karikatur Darstellung der sechs Migration Stufen. Vor-Migrations (i): In Seeder Kammer Spindelform zerteilbaren Zellen allmählich aneinander entlang zu wandern. Die Zellen in der Nähe Mikrokanal Eingang Rennen miteinander durch polarisierende Zellkörper und E xerting Lamellipodien Vorsprung. Initiation (ii): Der wandernde Zelle mit der höchsten Kapazität belegt den Kanal Eingang, während ihre Wettbewerber zurückziehen. Path-Exploration (iii): Die wandernde Zelle Änderungen an einem amoeboid-Modus mit wenig Polarität. Diese Migration Modus ist sehr beweglich und in der Lage, Pfad in alle Richtungen zu erforschen, indem blebbing kleinen Membranausstülpungen. Cruising (iv): Sobald das Migrationspfad bestimmt wird, wandelt die Zelle in eine angepasste amöboiden Modus durch Aufrechterhalten eines zusätzlichen großen Vorsprungs Position nach vorne. Auf diese Weise hält Zelle eine hohe Beweglichkeit sowie eine feste Richtung und Geschwindigkeit. Destination-Exploration (v): Nach Weg-End, verlangsamt sich die Zelle nach unten und entwickelt filopodias den Aufnahmeraum für eine Invasion Ziel zu erkunden. Post-Migration (vi): Nach Eingabe der Aufnahmeraum, dreht Zelle in sternförmige und behält eine hohe Beweglichkeit, aber keine bestimmte Richtung. "/> . Abbildung 4 Snapshots der Zeitraffer zeigen den Zyklus der blebbing Aktivität und Membranverformung einer BTSC: (AB). Initiierung; (BD). Expansion; (DF). Rückzug. Die Pfeile und Kurven-Linien repräsentieren die Richtung und Lage der Membranverformung sind. Die Snapshots werden alle 8 Sekunden gesammelt.