A PCR-based metodo di genotipizzazione di distinguere tra le varietà selvatiche di tipo ornamentale e di Imperata cylindrica</em

1. Raccolta e Conservazione Questo metodo è stato sviluppato e testato utilizzando freschi, congelati e tessuti fogliari di recente secchi. Identificare cogongrass e / o JBG tessuti con l'aiuto di un tassonomista specializzata nell'identificazione delle specie erba. Con le sue foglie di colore rosso vivo, JBG ornamentale è facile distinguere visivamente da wild-type cogongrass e JBG tornare, tuttavia, cogongrass e JBG tornare sono quasi indistinguibili gli uni dagli altri. Cogongrass e il fenotipo JBG hanno ripristinato verdi, foglie, rizomi molto più grandi e più a lungo, e l'area fogliare più di JBG 12 (Figura 1). Tessuto fogliare Fresh offre il DNA qualità più abbondante e più alto e può essere raccolto dal campo o serra cresciuta I. cylindrica piante. Se il tessuto fresco deve essere utilizzato, estrarre il DNA entro 3 ore dalla raccolta per aiutare a prevenire il degrado. Altrimenti, preparare il tessuto per lo stoccaggio, keeping il tessuto fresco e dalla luce solare diretta. Per memorizzare i tessuti di estrazione del DNA in una data successiva, il metodo più ottimale è di congelare il tessuto e conservare a -80 ° C immediatamente. Non permettere che il tessuto congelato a scongelare prima dell'estrazione del DNA. Trasferire il tessuto congelato in azoto liquido prima delle fasi di macinazione di estrazione del DNA per evitare lo scongelamento. Se un congelatore a -80 ° C non è disponibile, asciutto il tessuto immediatamente. Per lo stoccaggio secco, posizionare il tessuto in una busta di carta e memorizzare la busta in gel di silice disidratati o altri materiali essiccanti attivi a temperatura ambiente. Una piccola quantità di silice indicatore misto a non indica silice garantirà che la silice è completamente disidratato e adatto essiccazione tessuti vegetali. Utilizzare almeno 10 volte superiore a gel di silice tessuto della foglia fresca in peso. Tessuto vegetale deve asciugare entro 24 ore. La qualità e la quantità di DNA viene ridotto mediante stoccaggio a secco nel tempo (come nel caso del campione erbarios). 2. Estrazione del DNA Per estrarre il DNA da tessuto vegetale, seguire la DNeasy Plant Mini Kit (Qiagen, Valencia, CA; Cat # 69104 o 69106) le istruzioni del produttore con una modifica minore. Invece di utilizzare il suggerito meno di 100 mg di tessuto fresco o inferiore a 20 mg di tessuto secco, per ciascuna colonna, macinare superiore a 100 mg, e poi trasferire 100 mg di tessuto fresco o congelato (o> 20 mg di tessuto asciutto) idonee provette per l'estrazione. DNA nucleare e plastidio viene estratto simultaneamente. Prima di iniziare queste procedure, verificare che l'etanolo è stato aggiunto al buffer AP3 / E e AW. Macinare> 100 mg di tessuto fogliare fresche o congelate (o> 20 mg di tessuto fogliare secca) di una polvere fine con tre cicli di macinazione con azoto liquido in un mortaio e pestello refrigerati. Interruzione insufficiente del materiale di partenza o lisi insufficiente possono anche determinare una riduzione dei rendimenti di DNA. Con attenzione macinare il TISSue e non sovraccaricare le colonne con i tessuti troppo. Trasferire 100 mg di polvere congelata da tessuto fresco o congelato (o 20 mg di polvere secca da tessuto) in una provetta da 1,5 ml contenente 400 pl di tampone AP1 e 4 pl di RNasi A. Ogni tubo può essere collocato in un rack su un piccolo equilibrio per monitorare il peso corretto del tessuto per provetta. Campione Vortex o shake (s) per miscelare e incubare per 10 min a 65 ° C, invertendo il tubo (s) 2-3 volte durante l'incubazione. Aggiungere 130 ul di tampone AP2 a ciascun campione. Miscelare capovolgendo la provetta (s) più volte, e incubare per 5 min in ghiaccio. Pipettare ogni lisato in una colonna separata rotazione Mini QIAshredder, e posizionare ogni colonna in un tubo di raccolta 2 ml (fornito con il kit). Centrifuga colonna (s) per 2 min a 20000 g (circa 14000 rpm), e trasferire ogni flusso-through frazione in un nuovo tubo (non fornito con il kit) senza interrompere alcuna forma pellet. Aggiungere 1,5 volumi di Buffer AP3 /E, e mescolare pipettaggio. Trasferire 650 ul di miscela in una colonna DNeasy giro Mini in una provetta 2 ml di raccolta. Centrifuga colonna (s) per 1 min a 6.000 g (~ 8000 rpm), ed eliminare il flusso-through. Ripetere questo passaggio con l'impasto rimanente per ogni campione. Porre la colonna spin (s) in un nuovo tubo di raccolta 2 ml (s), e aggiungere 500 microlitri di Buffer AW alla parte superiore di ogni colonna. Centrifuga colonna (s) per 1 min a 6.000 xg (~ 8000 rpm), e scartare flusso passante. Aggiungere 500 pl di un tampone AW alla parte superiore di ciascuna colonna. Centrifugare per 2 min a 20000 g (circa 14000 rpm). Questo passaggio asciugare la colonna, eliminando così qualsiasi etanolo residua contenuta nel buffer che possono inibire PCR. Trasferire ogni colonna di selezione per una nuova provetta da microcentrifuga 1,5 ml. Aggiungere 100 pl AE Buffer all'inizio di ogni colonna di eluizione, e incubare colonna (s) per 5 min a temperatura ambiente. Centrifuga colonna (s) per 1 min a 6.000 xg (circa 8000 rpm) per raccogliere il DNA. Ripetere questi passaggi eluizione una volta, eluendo il DNA nella stessa provetta 1,5 ml per microcentrifuga per dare 200 pl di campione. I campioni di DNA Conservare a -20 ° C fino all'uso. Concentrazioni di DNA dipendono dal tipo di tessuto e le condizioni di conservazione. Rese ottimali si ottengono quando eluendo DNA con un totale di 200 pl di tampone AE, tuttavia, le concentrazioni può essere aumentato se volumi di eluizione vengono ridotte a un minimo di 50 pl. 3. Verifica della qualità e quantità del DNA Testare la qualità e la quantità di DNA estratto prima configurazione PCR utilizzando uno spettrofotometro o fluorometro e elettroforesi su gel. Ciò contribuirà a garantire il successo delle fasi successive. Utilizzando uno, spettrofotometro qualità e quantità del DNA di prova. Buone rese DNA dovrebbe essere tra 50 e 150 ng / ml con 260/280 e 230/280 rapporto vicino a 2,0. Come esempio, la Figura 2 mostra risultati di buona qualità utilizzando lo spettrofotometro NanoDrop (ThermoScientific, Wilmington, DE). Effettuare elettroforesi utilizzando uno standard di gel di agarosio all'1%. Verificare la presenza di bande relativamente grandi (> 10 Kb) senza striature di poco da contaminazione RNA (Figura 3). Se la concentrazione di DNA è alta, campioni di DNA diluiti a 70 ng / pl per le fasi successive. 4. Primer PCR I primer PCR usati in questo protocollo si basano sulle differenze di sequenza tra il plastidio trnL-F regione spacer di genotipi cogongrass e JBG. Queste differenze si presentano sotto forma di SNP (polimorfismi a singolo nucleotide) e indels (Inserimenti ed eliminazioni) che hanno permesso lo sviluppo di varietà di primer specifici, individuando i primer nei siti di sequenze uniche (Figura 4). La qualità dei primer può avere un impatto significativo sui risultati PCR. Primer ordine da una società rispettabile. Ordiniamo i nostri primer da Oblique Bio, Inc. (:/ / Www.obliquebio.com/web/ "target =" _blank "> http://www.obliquebio.com/web/, Huntsville, AL), richiedendo solo procedure standard dissalazione. trnL-F primer di controllo positivi: Questa serie di primer amplifica il plastidio trnL-F regione distanziatore di taxa più erba 11-13 e serve come un buon controllo positivo (risultante in una banda di 890 bp). Nome Sequenza TRNF (GAA)-F 5'-ATTTGAACTGGTGACACGAG-3 ' trnL (5 'esone)-C 5'-CGAAATCGGTAGACGCTACG-3 ' Wild-type primers cogongrass: Questa serie di primer è specifico per cogongrass e non amplificare il trnL-F regione JBG genotipi. I risultati esposti in una band che è 595 bp. Nome Sequence trnLF-C-F1 5'-TCCACTTTTTTGAAAAAACAAGTGCAA-3 ' trnLF-C-R1 5'-GCCGATACTCTAATAAATAAAAAAAAAAAAGAAAT-3 ' JBG e JBG Revert primers: Questo set di primer specifico per JBG genotipo e non amplifica il trnL-F regione cogongrass. I risultati esposti in una band che è di 594 bp. Nome Sequenza trnLF-R-F2 5'-CCAAATCCACTTTTTTGAAAAAACAAGTGGTT-3 ' trnLF-R-R2 5'-CGAGATTCCTTGCCGATACTCTAATAAAA-3 ' Risospendere ciascun primer in un volume sufficiente di nucleasi libera ddh 2 O per ottenere una soluzione stock di 100 mm che possono essere conservati a -20 ° C, a lungo termine. Diluire ogni stock innesco a 12 mm prima delle operazioni di messa in PCR. 5. PCR Setup Estrazioni DNA sono amplificate utilizzando ciascuna delle serie di primer sopra nelle reazioni PCR. Includere un controllo positivo per assicurare che tutti i reagenti PCR stanno lavorando bene e in grado di generare una band. Includere un controllo negativo per garantire che nessuno dei reagenti sono contaminati con il DNA indesiderato. Il controllo negativo contiene no-modello e dovrebbe portare a nessuna produzione band. Preparare tutte le reazioni a tubi con pareti sottili PCR per consentire il trasferimento del calore tra il blocco termociclatore e il campione. Si consiglia di utilizzare commercialmente disponibili aerosol privi di punte di pipetta per evitare la contaminazione. Per ciascun campione di DNA isolato, costituito da 50 pl reazioni PCR utilizzando ciascuno dei set di primer di cui sopra in 0,2 ml parete sottile provette PCR aggiungendo i seguenti reagenti on Ice nell'ordine elencato di seguito. Se più campioni vengono preparati, un cocktail contenente tutti i reagenti trannedello stampo di DNA a stabilire condizioni uniformi tra tutte le reazioni. PCR Reagente Volume Usato Concentramento finale Priva di nucleasi ddh 2 O 40,5 pl Vantaggio 2 10X PCR Buffer (Clonetech, CA) 5,0 pl 10% (v / v) Advantage ultrapura PCR dNTP Mix (10 mm ciascuno, Clonetech, CA) 1,0 pl 0,2 mM Primer 1 (12μM in ddh 2 O) 1,0 pl 0.24 pM Primer 2 (12μM in ddh 2 O) 1,0 pl 0.24 pM Vantaggio 2 Mix polimerasi (Clonetech, CA) 0,5 pl 1% (v / v) Estrazione del DNA(70 ng / reazione, regolare il volume ddh 2 O, se necessario) 1,0 pl 1,4 ng / ul Totale: 50,0 pl Per garantire che tutti i reagenti PCR stanno funzionando bene, impostare il controllo positivo utilizzando i primer di controllo positivo. Questo set di fondo funziona altrettanto bene per cogongrass, JBG, JBG ripristinare e altre erbe e si tradurrà in una band che è 890 bp. Impostare il controllo negativo utilizzando il primer di controllo stessa impostato come controllo positivo, utilizzando ddh 2 O invece l'estrazione del DNA. Se tutti i reagenti sono privi di DNA contamina, questa reazione comporta alcuna banda. Se la concentrazione di DNA è bassa, più DNA può essere aggiunto a ciascuna reazione, regolando la quantità di priva di nucleasi ddh 2 O utilizzato per portare il volume totale di reazione di 50 pl. Non utilizzare più di 5 pl di DNA (10% dei il volume totale) per reazione, come possibili impurità contenute nei campioni di DNA può inibire reazioni PCR. 6. PCR Ciclismo Effettuare amplificazioni di PCR in un termociclatore dotato di un coperchio riscaldato utilizzando i seguenti parametri di ciclismo PCR. Usiamo il Mastercycle pro S termociclatore (Eppendorf, Hauppauge, NY) impostato per operare con condizioni standard Ramping temperatura. Qualsiasi termociclatore qualità dovrebbe funzionare bene. Ciclo Denaturazione di ricottura Polimerizzazione 1 2 minuti a 95 ° C 2 30 sec a 95 ° C 30 secondi a 61 ° C 90 sec a 68 ° C 35 cicli 3 5 min a 68 ° C Mantenere a 4 ° C fino a quando il campione viene rimosso </td> Ottimizzare le condizioni di PCR (inclusa la temperatura di ricottura innesco, i tempi di estensione, e il numero di cicli) come necessario in base alla qualità del DNA, primer, polimerasi Taq o tipo di termociclatore utilizzato. Si consiglia di utilizzare un termociclatore gradiente per determinare il grado ottimale ricottura temperature. Se il termociclatore utilizzata non ha un coperchio riscaldato, aggiungere 1 goccia di olio minerale all'inizio di ciascun campione per impedire l'evaporazione durante i cicli PCR. 7. Elettroforesi su gel dei prodotti PCR Per visualizzare i risultati dell'analisi, separate prodotti di PCR su un gel di agarosio all'1% mediante elettroforesi standard. Combinare 2 microlitri di tampone standard carico DNA (tipicamente una soluzione 5x o 6x) con 5 pl di ciascun prodotto amplificato PCR. Caricare i campioni su un gel di agarosio 1% contenente EtBr (bromuro di etidio per la colorazione del DNA) e realizzato conither TAE o SB (borato di sodio) sistemi tampone 16. Usiamo 1 pl di una mg / ml 10 soluzione madre EtBr per 100 ml di 1% agarosio (0,1 mcg / ml). Eseguire campioni a ~ 120V finché il fronte del colorante raggiunge ¾ della lunghezza totale del gel. Sotto la luce UV (per esempio un breve box onda della luce UV), controllare le bande risultanti per vedere se un frammento del caso è stato amplificato. Documentare il gel e le fasce risultanti disponibili utilizzando un sistema di documentazione fotografica o una telecamera. 8. Risultati rappresentativi Dopo visualizzazione dei prodotti PCR, cogongrass ha un modello unico bande rispetto a quella di JBG o ripristinato JBG (Figura 5). Per ciascun campione di DNA, il trnL-F positive set di primer di controllo dovrebbe sfociare in una singola ad alta intensità di banda a ~ 890 bp. Questo verifica che tutti i reagenti PCR stanno funzionando bene. Allo stesso modo, il controllo negativo (senza maschera) reazione dovrebbe contenere bande per ogni s innescoet utilizzato. Ciò verifica che nessuno dei reagenti sono stati contaminati. Se il campione di DNA è derivato dal tipo selvatico cogongrass, una reazione di PCR utilizzando il cogongrass-specifica serie di primer si tradurrà in una singola banda ~ 595 bp, mentre i primer specifici JBG comporta alcuna banda. Analogamente, se il campione di DNA è derivata da JBG o ripristinato JBG, una reazione di PCR utilizzando il JBG-specifica serie di primer si tradurrà in una singola banda ~ 594 bp, mentre i primer specifici cogongrass comporta alcuna banda. Perché JBG, tornando JBG hanno identica sequenza di acido nucleico, avranno quindi hanno identici modelli di bande. Se molti campioni devono essere confrontati su un gel al tempo stesso, si consiglia di eseguire tutti i campioni derivati ​​da ciascun primer uno accanto all'altro, rendendo così più facile per la scansione dei campioni di risultati positivi. Differenze morfologiche tra JBG e JBG ritorna sono abbastanza evidenti (ad esempio il colore rosso delle foglie e piccoli di statura JB G contro la colorazione verde, più grande statura e la crescita aggressiva della JBG tornare), così mentre i risultati PCR sarà lo stesso, le varietà JBG sono facili da distinguere utilizzando morfologia delle piante. Figura 1. Confronto tra effetto serra cresciuta Imperata cylindrica var. Koenigii (erba sangue giapponese), Annullate I. cylindrica var. koenigii (JBG Ripristina) e I. cylindrica (Wild-type cogongrass). Figura 2. Un esempio di campioni di DNA verificate utilizzando uno spettrofotometro NanoDrop. Si noti che, indipendentemente dalla spettrofotometro utilizzata, il rapporto di 260/280 deve essere vicino a 1,8 e il 260/230 dovrebbe rapporto vicino a 2,0. ONTENUTO "> Campioni di DNA Figura 3. Verificata usando standard di gel elettroforesi su un gel di agarosio all'1%. Un marcatore del DNA commerciale è stato utilizzato per l'analisi dimensioni. Lane # 4 è un esempio di campione di DNA scarsa qualità, mostrando sbavature e qualche contaminazione RNA. Allineamenti di sequenza Figura 4. Delle trnL-F regioni Imperata cylindrica var. Koenigii (erba sangue giapponese), Annullate I. cylindrica var. koenigii (JBG Ripristina) e I. cylindrica (Wild-type cogongrass). Verticali frecce nere indicano differenze nelle sequenze risultanti dal SNP e indels. Orizzontali frecce verdi indicano le posizioni delle wild-type primers cogongrass utilizzati per cogongrass-PCR specifica. Orizzontali frecce rosse indicano il Poquisizioni della JBG e JBG Ripristina primers utilizzati per JBG-PCR specifica. Figura 5. Risultato rappresentativa di elettroforesi su gel di prodotti di PCR derivati ​​da cogongrass, JBG e JBG ripristinare campioni di DNA combinati con cogongrass-e JBG primer specifici nonché la trnL-F controllo positivo e un modello nessun controllo negativo.