Summary
Um método é descrito para photoactivate células individuais contendo uma proteína fluorescente enjaulado usando absorção de dois fótons de uma Ti: Sapphire oscilador laser de femtossegundos. Para mapear o destino da célula fotoativados, imuno-histoquímica é usada. Esta técnica pode ser aplicada a qualquer tipo de célula.
Abstract
A capacidade de uma única célula diferencialmente rótulo tem implicações importantes na biologia do desenvolvimento. Por exemplo, determinar como hematopoiético, as linhagens de vasos linfáticos e sanguíneos surgem em embriões em desenvolvimento exige o mapeamento destino traçado e linhagem de células precursoras indiferenciadas. Recentemente, proteínas photoactivatable que incluem: Eos 1, 2, 3 PAmCherry, Kaede 4-7, pKindling 8, e KikGR 9, 10 receberam grande interesse como sondas celular de rastreamento. O espectro de fluorescência destas proteínas fotossensíveis podem ser facilmente convertidos com excitação UV, permitindo uma população de células para ser distinguido de outras adjacentes. No entanto, a foto-da proteína ativada pode limitar a longo prazo de células de rastreamento 11. Como uma alternativa às proteínas photoactivatable, enjaulado fluoresceína-dextran tem sido amplamente utilizado em sistemas de embrião modelo 7, 12-14. Tradicionalmente, para libertar da gaiola de fluoresceína-dextran, excitação UV de uma casa de lâmpada fluorescente ou um laser UV de fóton único tem sido usada, no entanto, tais fontes limitar a resolução espacial de fotoativação. Aqui nós relatamos um protocolo para mapear o destino, traçar a linhagem, e detectar única células marcadas. Células individuais de embriões injetados com enjaulado fluoresceína dextran são fotoativados com pulsos de laser infravermelho próximo produzido a partir de um laser de femtossegundos de titânio safira. Este laser é de costume em todos os microscópios confocal de dois fótons, como o LSM 510 META NLO microscópio utilizado neste trabalho. Como o tecido biológico é transparente ao infravermelho próximo irradiação 15, os pulsos de laser pode ser focalizado no fundo do embrião sem uncaging células acima ou abaixo do plano selecionado focal. Portanto, não-linear de absorção de dois fótons é induzido apenas no foco geométrico para libertar da gaiola de fluoresceína-dextran em uma única célula. Para detectar a célula que contém uncaged fluoresceína-dextran, nós descrevemos um protocolo de imuno-histoquímica simples 16 a rapidamente visualizar a célula ativada. O protocolo de ativação e de detecção apresentado neste artigo é versátil e pode ser aplicado a qualquer sistema modelo.
Nota: Os reagentes utilizados neste protocolo pode ser encontrado na tabela anexada ao final do artigo.
Protocol
Discussion
Este artigo descreve um método versátil para mapeamento única célula destino baseado na fotoativação de gaiola de fluoresceína-dextran. Uncaging de fluoresceína-dextran enjaulado em uma única célula é obtida através de dois fótons de absorção de um laser de femtossegundos Mai Tai acoplada ao microscópio Zeiss LSM 510 META confocal. Uncaged fluoresceína-dextran em células fotoativados é rapidamente visualizada através de um procedimento simples imuno-histoquímica.
Neste protocolo o comprimento de onda de absorção de dois fótons para fotoativação de gaiola de fluoresceína-dextran é 740 nm. Este comprimento de onda foi determinado experimentalmente por photoactivating enjaulado fluoresceína-dextran embriões tipo selvagem injetado. O comprimento de onda de excitação do laser foi variado 600-800 nm, ea presença ou ausência de fluoresceína de fluorescência de pós-ativação foi qualitativamente determinado. Nós descobrimos que 740 nm produziu a ativação de sinal mais forte de fluoresceína seguinte. Idealmente, 740 nm deve funcionar para todos os sistemas do modelo, no entanto, aconselhamos testar uma gama de comprimentos de onda para determinar o comprimento de onda de excitação ideal de dois fótons de sua amostra.
Em gaiolas de fluoresceína-dextran embriões tipo selvagem injetado, para cada comprimento de onda de excitação de dois fotões testado também variadas a potência do laser média. Para um comprimento de onda de excitação de 740 nm, uma potência do laser média de 47 mW produziu um sinal mais forte de fluoresceína na região ativada em comparação com menores poderes a laser média. Maior poder de laser média não produzem sinais mais fortes de fluoresceína, mas a ablação induzida do tecido. Desde pulsos de laser de femtossegundos são eficientes na ablação de tecido biológico 15, recomendamos determinação do limiar de potência do laser média de fotoativação que evita a ablação de tecido.
Dois fótons absorção ocorre dentro de um volume pequeno de interação. Para garantir a activação correcta de gaiola de fluoresceína-dextran, a célula deve ser trazida para o foco correto. No protocolo acima, as células GFP positivas foram simultaneamente fotografada sob luz branca para confirmar o foco da célula. Portanto, a aquisição de luz branca, além de outros canais é aconselhável. Após a confirmação de foco de células, nosso protocolo sugere ampliação da célula ativada. Um fator de zoom de 50 a 70 é sugerido, no entanto, este valor depende do tamanho da célula escolhida. Aumentar o zoom isola a célula ativada a partir de células adjacentes, e limita a área de digitalização de dois fótons ativação. Idealmente, a área de digitalização deve cobrir uma grande área da célula.
Detecção de células ativadas único requer que a coloração de fundo ser mínima. No protocolo imunodetecção acima, é importante que a amostra está bloqueada em tampão de bloqueio por 5 a 6 horas (passo 4.13). Ao desenvolver com NBT / BCIP, uncaged fluoresceína-dextran deve tornar-se visíveis em 10 a 20 minutos. Se é forte coloração de fundo, sugerimos um maior tempo de bloqueio e lavagens adicionais para remover os anticorpos (passo 4.17).
Figuras 1 e 2 fornecem resultados representativos de fotoativação e imunodetecção. Na Figura 1, os primeiros 1 – a 2 células de embriões tipo selvagem fase foram injetados com gaiola de fluoresceína-dextran. Os embriões foram criados para somitogenesis médio e montado em baixa temperatura de fusão agarose na orientação lateral. Figura 1 (a, b) mostram claro e imagens fluorescentes do embrião antes de fotoativação. Evidência de que o embrião permaneceu uncaged é demonstrado pela ausência de fluorescência da fluoresceína na Figura 1 (b). Uma pequena região dentro de um somito foi ativado com um comprimento de onda de 740 nm por 31 segundos usando um laser de potência média de 47 mW, a Figura 1 (c; seta). Pós-ativação, uncaging dois fótons de fluoresceína-dextran ocorreu como mostra a fluorescência da área ativada, Figura 1 (d; seta). Ativação não foi acompanhada por ablação a laser, como o tecido somítica permaneceu Figura, intacta 1 (c). Figura 2 demonstra a imunodetecção de uncaged fluoresceína-dextran. Uma pequena região no mesoderma da placa lateral de um embrião de estágio de 10 somito foi fotoativado usando os parâmetros do laser mesmo, como mencionado na Figura 1. O embrião foi criado e processado utilizando os passos 4.1 até 4.20. A seta na Figura 2 localiza a região ativada, como indicado pelo acúmulo de precipitado azul. Apenas a localização ativado é claramente detectado sem interferir coloração de fundo.
Preparação das soluções:
1 X PBT (1 L)
100 mL 10 X PBS
2 g BSA
10 mL de Tween 20%
10 X PBS (1 L)
80 g de NaCl
2 g KCl
6,1 g Na 2 HPO 4
1,9 g KH 2 PO 4
DDH 2 O em 1 L
pH para 7,3
Paraformaldeído 4% (160 mL)
Paraformaldeído 32% (dois frascos de 10 mL)
8 mL 20 X PBS
132 mL DDH 2 O
1 mL de NaCl 5 M
2,5 ml 1 M MgCl 2
5 mL 1 M Tris pH 9,5
250 mL de Tween 20%
41,25 mL DDH 2 O
Solução de anticorpos (para 1 amostra)
5,5 mL de acetona em pó
40 mL PBT
0,8 mL LS
0,1 de anticorpos Anti-fluoresceína-AP mL
LS 2% (360 mL de uma amostra)
7,2 mL LS 100%
352,8 mL PBT
1 X Danieau media (1 L) ‡
11,6 mL de NaCl 5 M
700 mL KCl 1 M
400 mL 1 M MgSO 4
600 mL 1 M Ca (NO 3) 2
5 mL 1 M HEPES
DDH 2 O em 1 L
pH ajustar para 7,6
‡ Danieau é uma solução de sal ideal para a criação de embriões zebrafish dechorionated. Outros meios de comunicação podem ser usados, desde que sejam corretamente com soluções isotônicas osmolaridade (mOsm ~ 300 para zebrafish)
NBT estoque (1 mL)
50 mg Nitro Blue Tetrazolium
0,7 mL de anidrido dimetil formamida
0,3 mL DDH 2 O
BCIP estoque (1 mL)
50 mg 5-bromo-4-cloro-3-indolil fosfato
1 mL de anidrido dimetil formamida
NBT / BCIP solução desenvolvimento
1 mL tampão AP
4,5 mL NBT estoque
3,5 mL de ações BCIP
Pó de acetona
- Selecione 20 peixes adultos e congelá-los em nitrogênio líquido.
- Moer o peixe congelado com um almofariz e pilão de um pó.
- Transferir o pó de peixe em um tubo cônico de 50 mL.
- Encha o tubo cônico com acetona 100%. Vortex do tubo.
- Girar o tubo no máximo rpm por 10 minutos. Desprezar o sobrenadante.
- Lavar o pellet de mais 3 vezes em acetona 100% e girar o tubo no máximo rpm por 10 minutos. Pela última lavagem, o sobrenadante deve aparecer claro.
- Adicionar 100% de acetona para a pelota de novo e deixar o tubo repousar à temperatura ambiente. As partículas mais densas vai resolver, enquanto as partículas mais finas permanecem em suspensão.
- Decantar as partículas finas em um novo tubo. Solução alíquota do pó em tubos separados e armazená-los a -20 ° C.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a J. Chen para fornecer o protocolo de síntese enjaulado fluoresceína-dextran. Esta pesquisa foi suportada pelo March of Dimes prêmio 5-AF09-78, a American Heart Association 09BGIA2090075 prêmio, eo prêmio NIH / NHLBI HL107369 R01-01 a SS Um agradecimento especial a C. Closson por sua assistência microscopia.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
|---|---|---|
| CMNB-caged fluorescein SE | Invitrogen | C20050 |
| 10 kDa Aminodextran | Invitrogen | D1860 |
| Zeba Desalt Spin Column | Pierce | 89889 |
| Low melting agarose | Amresco | 0815-100G |
| Sodium Borate | Amresco | 1131117-100G |
| Tricaine Methylsulfonate/ MS222 | Research Organics | 1347A |
| Anti-fluorescein-AP | Roche | 11376622 |
| Blocking buffer | Roche Applied Sciences | 11 096 176 001 |
| Maleic Acid | Sigma | MO375-500G |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15714 |
| NBT | Sigma | I8377-250mg |
| BCIP | Fischer Scientific | PI-34040 |
| Microinjector | Harvard Apparatus | PLI-2000 |
| LabTek chambered coverglass slides | Nalge Nunc International | 155380 |
| Proteinase K | Invitrogen | AM2544 |
| Lamb serum | Invitrogen | 16070096 |
| LSM 510 META NLO | Zeiss | |
| 20X 0.8 NA Air apochromatic objective | Zeiss | |
| Transparent yellow filter | Theatre House Inc. | Roscolux filter sheet Color: 312 |
References
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