Karaciğer Hücreleri Karaciğer Perfüzyon Arıtma Takip in vivo Karaciğer endositoz

1. Karaciğer eksizyonu (değişiklikler 14,15 PO Seglen 12 ve R. Blomhoff 13 kabul) 5.5 L odasında kapalı bir petri polietilen glikol izofluran 10 ml% 30 ekleyin. Bu odanın içinde stabilize bir atmosfer yaratmak için izofluran eklenmesinden sonra 10-15 dakika beklemek en uygunudur. Kapalı odasında bir fare koyun ve anestezi olmak için izin verir. Anestezi tam etkileri hayvan tepkisiz, gevşek olduğunda fark edilir ve derin nefes alma sergiler. 2 ml, 30 ml şırınga tüpün alt kısmında bazı pamuk topları polietilen glikol izofluran Yeri. Bebek bezi kaplı bir tepsi ve burnu üzerinde şırınga tüp sırtında sıçan yerleştirin. % 70 etanol ile karın ıslatma hemen derin anestezi onaylayın. Hayvan izofluran doz aşımı ölmesine izin vermeyin. Bandaj makasları ve forseps kullanma, tüm abd maruzominal kavite. Vena porta bulun ve forseps kullanarak, iki kısımlı mezenterik şube hemen üzerinde vena porta altında cerrahi ipek veya polyester iplik (ligatür) çizin. Forseps çekiniz ve gevşek bir overhand düğüm. Vena porta altında forseps kullanma ve damar düzeltmek için hafifçe geri çekilerek, bir Insyte Autoguard kateter (18 GA, 1.3 x 300 mm, BD Biosciences) veya benzeri bir kateter ile ven cannulate. Kateter parçacığı tarafından oluşturulan döngü ötesinde birkaç mm gitmeli. Kateter yaylı tetik serbest iğne geri çekin ve çıkartın. Kan uygun ligatürün yerleşimini gösteren kateter içine sızan başlamalıdır. Overhand düğüm aşağı sıkın ve başka bir overhand düğümle sabitleyin. Inferior vena kava veya inen aorta (aorta abdominalis), kan dolaşım sistemi tahliye izin ya Sever. Oksijenli ile karaciğer kızarma başlayınTBS ° 37 ° C 20 ml / dk akış hızında, kan (beyazlaşma) kaldırmak için. Karaciğer, kırmızımsı mor bir balçık renk açmak gerekir. Karaciğer kızarma olmasına rağmen, tüketim, gastrointestinal sistem ve bağ dokusu kesim tarafından karaciğer. Karaciğer veya delinme Glisson kapsül delici için önemlidir. Plastik tamponlar toplanan ve sirküle olması için olanak sağlayan bir huni üzerinde net karaciğer yerleştirin. Bu noktada Tamponlar sirküle, ancak atık behere akışı olmamalıdır. Flushing 10 dakika daha fazla sürmemesi. (Şekil 2A). Adım 2.1 'de gerekli endositoz çözüm hazırlayın. 2. 125 I-SA-b-Hep (ya da diğer uygun etiketli ligand), içselleştirme Küçük bir behere 50 ml RPMI ortam, nihai konsantrasyonu% 0.05 BSA ve 0.01 mCi 125 I-SA-b-Hep veya diğer şekilde etiketlenmiş endositoz ligand ekleyin. Bu beher takın apparatuoksijenasyon için izin vermek. , Pompa kapatın giriş tüp geçiş ve sonra 20 ml / dak pompa açmak. Etiketli RPMI karaciğer yaklaşırken, pompayı kapatın ve huni aşırı sıvı ve tüp drenaj izin. Etiketli medya devridaim izin ve sonra pompa yeniden başlatmanız drenaj boru medya behere koyun. Sıvılar, en fazla 1 saat için karaciğer yoluyla sirküle izin verin. Bu içselleştirme adım sırasında, karaciğerde sıcaklığı kapsayan ve kollajenaz sindirim için hazırlamak istikrarlı olduğundan emin olun. 3. Kollajenaz sindirim karaciğer sindirimi Taze çözünmüş ve süzülür (0,45 mikron) kollajenaz 37 60 ml geçmemek üzere toplam hacim ° C (100 mg / kg rat ağırlığı) 2 Tampon eklendi olmalıdır Hacmi boru uzunluğu / iç hacim bağlıdır ve buna göre ayarlanması gerekir. Pompa ve döviz DurdurTBS medya beher giriş boruları. Kalsiyum bağımlı desmosomal hücre kavşaklarından gevşeme sağlar dk 50 ml / 2 dk karaciğer yıkayın. Karaciğer kızarma, beher cihazın kollajenaz içeren medya beher değişimi. Hemen yıkamadan sonra, 20 ml / dak akış hızında 15 dakika kadar bir dolaşım döngü içinde kollajenaz ile sindirim başlar. Kollajenaz partiler çok sayısına göre farklılık gösterir, sindirim miktar ve zaman içinde değişiklikler kollajenaz her yeni parti için optimize edilmesi gerekir. Kollajenaz de kalsiyum bağımlıdır. Pompayı kapatın ve Flask B. (Şekil 2B) Flask Yatak atık hattı atık konteyner transfer Flask tampon ve gaz hatlarının geçiş. Pompa Dur, kateter kaldırmak ve 20-30 ml Tampon 1 içeren bir çanak karaciğer aktarmak. Geri Peel Glisson kapsül ve karaciğer hücre sallamaksıvı s. Sıvı hücresel malzeme ile opak hale geldikçe, 30 mikron mesh ile ve daha sonra 50 ml konik içine buz filtrasyon ile 100 mikron mesh yoluyla hücrelere aktarın. Karaciğer daha fazla Tampon 1 ekleyin ve mesh filtreleri ve konik sıvı, karaciğer matris hücreleri sarsmaya devam ediyor. Adımları tekrarlayın 3,7-3,9 artık hücreleri karaciğer makul sallayarak yerinden olabilir kadar. 4. Hepatosit ve SEC arıtma 3 dakika boyunca 150 xg'de hücreleri içeren 50 ml conicals Santrifüj. hepatositler pelet. Buz üzerinde taze 50 ml conicals olmayan parankimal hücre içeren sıvı kısmını aktarın. Hepatositler Tampon 3 pelet resuspending ve adımları 4.1 ve 4.2 en fazla üç defa tekrar yıkayın. Yıkar sonunda, pelet ≥% 97 saf hepatositler. Sn elde etmek için, tüm borular c santrifüj10 dakika için 200 xg (HKH'lerin, saniye, ve KCS ve bazı küçük hepatositler içeren) supernatant toplanmış ontaining. 4 ° C Tampon aspire 4, 5 ml RPMI / BSA tüm pelet ° C tekrar süspansiyon 2 tüp içine hücreleri birlikte Havuz ve 35 mL bir birime kadar RPMI / BSA ekleyin. 3 dakika boyunca 100 xg'de conicals santrifüjleyin. En iyi 25 ml sıvı ve temiz bir 50 ml konik transfer toplayın. Kalan 10 ml medya pelletini tekrar ve tekrar soğuk RPMI / BSA 25 ml ve 3 dakika boyunca 100 xg'de santrifüj ekleyin. 3,8 ve 3,9 adımları tekrarlayın hücre pelet ve alt 10 ml medya, bir kez daha atın. Pelet saniye, KCS ve 10 dakika için 200 xg HKH'lerin supernatents santrifüjleyin. 4 ° C Buz 20 ml PBS içinde% 25 Percoll içeren üç 50 ml tüpler hazırlayın. Her bir tüp içinde 15 ml% 50 Percoll Underlay. 30 ml RPMI / BSA toplam hacmi hücre pelletleri tekrar Dikkatle bindirme eac4 h 20 dakika için 900 xg hücreleri ve santrifüj 10 ml degrade ° C SAN ve KCS batmaz yoğunlukları çok yakın ve% 25/50 arayüzü var. HKH'lerin / medya lipid depolama hücreleri gibi yüksek kaldırma kuvveti nedeniyle arayüzü tipik olarak 25%. Kalan hepatositler ve kan hücreleri düşük buoyancies ve pelet. 25/50% arabiriminin yanında yukarıdan aşağıya aspire ve bu malzemenin atın. 25/50% arayüzü ve soğuk RPMI ile taze bir konik hücrelerin toplayın. Son hacim Percoll sulandırmak için ~ 40 ml olmalıdır. 4 az 10 dakika süreyle 350 xg'de konik Santrifüj ° C pelet hücreleri. ~ 10 ml önceden ısıtılmış RPMI asitle yıkanmış cam Petri kabındaki 100 U / ml Penicillin/100 g / ml Streptomisin ve yer hücreleri içeren ya da çanak kristalize hücrelerin tekrar Hücreler 15 dakika inkübe edin. 37 ° C'de bir doku kültürü inkübatörde. Rock ya da girdap plakası birazve sonra süpernatantı sn toplamak. KCS saniye daha çok daha hızlı bir şekilde cama yapışır. Alternatif olarak, SAN, manyetik boncuk konjuge veya anti-Stabilin2/HARE anti-CD31 antikorları kullanarak immunopurification KCS ayrılmış olabilir. Canlılık ve hücre sayıları hemasitometre kullanarak tripan mavi dışlama ya da otomatik hücre sayıcı ile değerlendirilebilir. Kültür sn 37 ° fibronektin kaplı plastik tabaklar ° C,% 5 CO 2, 40 ng / ml VEGF, 100 U / ml penisilin, 100 mg / ml Streptomisin veya hepatosit klimalı ortam RPMI/0.25% BSA. Hepatositler, KCS ve SAN etiketli malzeme içselleştirilmesi için bir gama sayacı kullanımı ile değerlendirmek ve bu kültür yöntemleri kullanılarak (floresan ile işaretlenmiş) toplam hücresel protein veya mikroskobu ile normalize edilebilir. 5. Temsilcisi sonuçları: Hepatosit arıtma ≥% 97 ve SEC arıtma typicmüttefiki ≥% 95 bu yöntemi kullanarak. Karın boşluğunda, portal ven, kanülasyon, karaciğer, beyazlaşma eksizyonu en iyi sonuçlar için bir dakika içinde meydana gelmelidir. HARE/Stabilin-2, karaciğer sn belirli bir reseptör ve diğer karaciğer hücre tipleri ifade değildir. Bu örnekte, hepatosit ve SAN hem de hücre lizatları% 5 SDS-PAGE ile ayrıldı Stabilin-2 hem de izoformları (Şekil 3) karşı monoklonal antikor ile probed. Kan dolaşımına enjekte heparin, 16 karaciğer tarafından temizlenir . Gümrükleme, öncelikle hepatositlerde ve KCS 17 aksine, karaciğer sn tarafından yapılır . Stabilin-2/HARE reseptörüne bağlanır ve 18 saniye içinde heparin içselleştirmesi ana bir boşluk reseptör . Buradaki örnekte, biz GlcNAc / NS karboksilat grup biotin etiketiyle heparin etiketli. Biotin, içselleştirilmiş heparin Prot tespiti için iyotlu streptavidin ile konjugeeoglycan. Exsanguination tarafından takip etiketli heparin enjeksiyonu, enjeksiyon sonrası 30 dakika bize hangi organları heparinin bu formu içselleştirmek izlemenize olanak sağlar. Bu kısa zaman aralığında, karaciğer birincil gümrük organ (Şekil 4). Daha açık bir şekilde hücre tipi temizlenmesi için sorumlu olduğu anlamak için,% 0.05 BSA ile desteklenmiş RPMI medya I-SA-b-Hep 125 eklenir ve 20 dakika için karaciğer dolaşmasına izin. Kollajenaz sindirim ve hücresel arıtma ardından, etiketli heparin hepatositler (Şekil 5) aksine saniye içinde büyük bir çoğunluğu tarafından içselleştirilmiş. Şekil 1: Temel karaciğer mimarisi . Sn sinüzoidler duvarlarını oluşturmak ve normal (çevrelerin küçük kümeleri) Fenestre. Stellat hücreleri (HKH'lerin) Kupffer c aksine Disse Uzay bulundu.arşın (KCS) normalde sinüzoidler mikrovaskuleterini mevcuttur. Hepatositler Disse Uzay diğer tarafında işgal eder. Şekil 2 perfüzyon cihazların şematik. A) Karaciğer sinüzoidler kızarma / yıkama sırasında aparat Set-up. TBS, 1 litre cam şişe içinde. B) ~ 60 ml Tampon 2 kollajenazlarla içeren 125 ml şişeyi, bir kapalı devre karaciğer sindirim için kullanılır. Atık su hattı da lastik tıpa bir çentik kesi aracılığı ile atık konteyner balon B değiştirildi. Oksijen hattı kollajenaz (balon B) içeren köpük önlemek için tampon içine batmış değildir. Her balona Stoper atık su hattının etkin transferine izin vermek ve artan oksijen gazı basıncı önlemek için çentikli. Şekil 3. </sTrong> Hepatosit hazırlıkları saniye ile kontamine değildir. Eşit miktarda saflaştırılmış hepatositlerde gruplar halinde (şeritli 1) ve saniye (şeritli 2) cep lizatları% 5 SDS-PAGE ile ayrılmış ve nitroselüloz için lekelenen. HARE/Stabilin-2 hem izoformları (315 kDa ve 190 kDa) karşı spesifik monoklonal antikor # 30 lizatları prob kullanıldı. Şekil 4 organlarda etiketli heparin Dağılımı. Sıçanlar, 30 dakika boyunca 125 I-SA-b-hep beklemek lateral kuyruk damar yoluyla enjekte edilir ve daha sonra exsanguinated. Kan yapay olarak herhangi bir organ yüksek okuma vermek amacıyla toplanmıştır. Her organ dakika başına (BGBM) Sayımlar, gram olarak organ ağırlığını karşı normalize edildi. Şekil 5 hepatosit ve saniyede etiketli heparin miktarı. RPM125 içeren medya I-SA-b-Hep kollajenaz sindirim ve hücresel arıtma takiben 20 dakika için sağlam bir karaciğer ile dolaşmasına izin verildi. Eşit miktarda hepatosit ve SEC hücre proteini lizatları Bradford Testi sayısal ve bir gama sayacı tarafından sayıldı. Şekil 6 Kupffer hücreler cam üzerine yapışmasını sn ayrılır. Hücreler bir asitle yıkanmış cam kristalize çanak yerleştirilir ve 37 ° C,% 5 CO 2 15 dakika uyması izin verildi. Olmayan yapıştırılır hücreleri içeren supernatent hafifçe kıvrıldı ve bir santrifüj tüpüne yerleştirilir. % 8 SDS-PAGE ile ayrılmış iki cam yapıştırılır hücreleri (şeritli 1) ve olmayan yapıştırılır hücreleri (şeritli 2) lizatları lekelenen ve Kupffer hücreleri için spesifik CD163 karşı bir antikor ile probed. Fibronektin kaplı plastik kaplanmış Şekil 7 sn 6-iyi yemekler,% 0,1 BSA ile desteklenmiş RPMI bir gece inkübe edildi . (A) 100x ve (B), 200x büyütme Faz kontrastlı görüntüler alınmıştır.