针对嗅球神经元采用组合在体内电穿孔和GAL4基于增强陷阱斑马鱼线

1。转基因胚胎这里我们使用了斑马鱼转基因株系，通过转座子介导的增强陷阱的方法8。转基因插入包括编码序列KalTA4，一个优化版本的GAL4转录激活斑马鱼，和红色荧光蛋白，mCherry。增强陷阱的方法产量线的转基因斑马鱼，这种转基因盒表达内源性增强子序列的控制之下。因此，根据特定的增强子序列的身份，KalTA4和mCherry表达是本地化到发育中的大脑的特定区域。 ET（zic4：Gal4TA4，无人机：mCherry）hzm5线，我们在这里使用，表达本地化的几个地点，脑，后脑和具有特别重要的意义，在这里，嗅球8（见图1。） 。鉴于这种表达方式，和本地化的基因组内的录像带，转基因预测zic4 发起人 8的控制之下（ 见也http://www.helmholtz-muenchen.de/en/idg/groups/ 影像学/ lines_distel /主 ）。 成人ET（zic4：Gal4TA4，无人机：mCherry）hzm5鱼杂合子转基因插入通常与WT（AB）鱼交配，导致约50％的转基因后代。 （对于转基因后代的比例更高，两个杂合子可以交配。） 为了阻止色素形成和促进荧光成像，100μM的N -苯基硫脲嘧啶（PTU）在6-8 HPF开始对待转基因胚胎。 2。安装胚胎 24-28 HPF，转移胚胎蛋水，无机动部队。确定使用荧光显微镜的表达mCherry的转基因胚胎。取出用细镊子的转基因胚胎绒毛膜膜。传输中解脱出来，从胚胎绒毛膜培养皿中含有电加0.02％的缓冲tricaine [电穿孔缓冲：180毫米氯化钠，氯化钾5毫米，1.8毫米氯化钙 2，5毫米的HEPES，pH值7.2] 4 。允许2分钟的麻醉效果，然后再继续安装步骤。 微波解决方案，然后放置到一个34-37 ° C培养箱解决方案，准备一个0.5％的低融点琼脂糖电缓冲区加上tricaine解决方案。一旦琼脂糖溶液的温度平衡，将大幅下降（约500μL）的琼脂糖溶液60毫米培养皿的中心。 6-8麻醉胚胎的琼脂糖下降。 使用镊子（或减少microloader吸管提示罚款结束）的罚款，位置的胚胎，它们都面临着同一方向，并在一个垂直的行对齐。巩固琼脂糖和陷阱的胚胎中的位置，放到一个大培养皿中，用2-3毫米的冰盘。 一旦琼脂糖凝固后，洪水电缓冲区加上tricaine菜，以确保该解决方案完全覆盖凝固的琼脂糖下降。 3。显微注射DNA的表达质粒准备使用的MIDI或Maxi准备质粒提取试剂盒（如Qiagen公司）的绿色荧光蛋白表达质粒。挂起到终浓度为0.5μg/μL无菌水加0.03％酚红质粒。对于嗅球针对实验在这里，我们使用多个Gal4的结合位点（14无人机串联序列和基底鱼发起人，E1B）控制下的EGFP编码序列的表达质粒。将使用这种质粒，transgenically表达的KalTA4转录因子的细胞能够表达绿色荧光蛋白，因此，调解有针对性的表达绿色荧光蛋白。 注：在这里，我们使用的DNA注射，应针对发育中的大脑的其他地区适用的可视化酚红，只要该地区可以从心室​​访问。针对其他类型的细胞，需要荧光可视化，肾上腺素或Quantam点染料可能被用于可视化荧光灯照明下注射。 显微注射移液器可以采用水平或垂直的吸管拉马。热拉强度设置会有所不同拉马，加热元件的类型和玻璃毛细管的类型。 使用一个萨特的P – 30垂直拉拔器，使用了980的热定型和拉力为960，生产薄壁硼硅毛细管玻璃细丝长，逐渐变细，尖锐的移液器[萨特仪器＃BF100 – 78 – 10]。这些设置拉Microinjetion移液器是密封的，注射前必须打破。 使用microloader枪头，加1-2微升DNA质粒溶液注射针。 山和争取到的高压喷射系统移液器支架装入吸管。 回破用细镊子装入吸管，直到压力脉冲产生膨化释放红色的DNA溶液。另外，小技巧，可以迅速穿透水下，折叠实验室Kimwipe被打破。 注：因为注射移液器最初密封，必须手动回破，针尖大小和注射量是可变的。理想的注射移液器需要3-5注射脉冲完全填补24 HPF胚胎（100毫秒脉冲注入40 PSI）的前脑脑室发展。 质粒DNA溶液注入到发育中的大脑脑室这种DNA是迫使相邻，和闰成，注定要形成嗅球的大脑区域。嗅球是来自细胞在脑脑室前壁。因此，通过插入脑室注射针等移液器指向是对发育中的大脑前结束，高压喷射力量的DNA和相邻的准嗅球。注入的DNA，直到红色染料是清晰可见脑脑室前结束。因为DNA立即开始弥漫，稀释的DNA，重要的是进行电步骤尽快注射后（例如，10秒内）。 4。电穿孔使用自建草铂（草技术＃E2）皮下电极的电极进行电穿孔。电极连接到一个手持式探头，并最终铂电极之间的距离应为1毫米（在建筑的细节见 9） 。方波电脉冲产生的电极连接到一个草SD – 9刺激器（草技术，型号SD – 9）。 设置SD – 9刺激产生70伏单，5毫秒电脉冲。放置电极，正电极定位毗邻的胚胎前结束，而负电极后的胚胎头。手动启动〜7-8使用的SD – 9刺激的单一模式开关的电脉冲，每个脉冲分离〜1秒。适当的电压将取决于对胚胎的年龄和所使用的电压源。年轻的胚胎需要较低的电压，以避免胚胎的损害，而年纪大的胚胎需要更高的电压 ，启动电7。 允许胚胎，至少10分钟后，电恢复之前，使他们从琼脂糖。 用细镊子，免费琼脂糖胚胎轻轻跟踪胚胎的轮廓，同时避免与胚胎本身的实际接触。 一旦释放，返回的胚胎蛋水（与机动部队如果需要的话）。保持在28 ° C，直到他们将GFP表达成像。 5。成像安装胚胎胚胎转移，从鸡蛋的水，加上警察机动部队蛋水加0.02％tricaine。允许几分钟的麻醉效果，然后再继续安装步骤。 微波解决方案，然后放置到一个34-37 ° C培养箱解决方案，准备一个0.5％的低融点琼脂糖鸡蛋水加tricaine解决方案。一旦琼脂糖溶液的温度平衡，将大幅下降（约300μL）的琼脂糖溶液到35毫米的培养皿的中心。添加一个麻醉胚胎的琼脂糖下降。 使用镊子（或减少microloader吸管提示罚款结束）的罚款，位置的胚胎，他们是正直的，使它能够可视化的​​背视图，发育中的大脑与一个堂堂正正的显微镜（倒置的范围将需要不同的胚胎几何和不同的菜，可以从下面的可视化 ;看到12）。琼脂糖巩固放置到一个大培养皿中，用2-3毫米的冰菜。用细镊子将有可能在凝固过程中需要重新定位，以确保胚胎不落在其副作用。 一旦琼脂糖凝固，洪水盘鸡蛋水加tricaine确保该解决方案完全覆盖凝固的琼脂糖下降。 6。代表性的成果： 虽然GFP的表达，可以观察到早6个小时后，电，在这里，我们显示了从胚胎电后第4天，充分发展的目标细胞的突起结构图像。的ET（zic4：Gal4TA4，无人机：mCherry）hzm5转基因增强子陷阱线显示mCherry组成性表达（和KalTA4）在后脑，小脑，前脑，胚胎嗅球，在5天受精后（图1A和1C）。胚胎有一个UAS – GFP表达质粒针对性电（如上所述），显示绿色荧光蛋白的表达，是限制发展嗅球细胞（图1B，1D及1E）注册成立。只有细胞transgenically表达的KalTA4转录因子能够激活这个UAS – GFP的质粒表达。这个团到非转基因胚胎的质粒不会导致任何可察觉的GFP表达。因此，它是有针对性的UAS – GFP和本地化的KalTA4驱动程序，导致发展的嗅球细胞中GFP的独家表达的转基因表达电的联合行动。表达GFP的细胞显示出典型的轴突预测嗅球僧帽细胞（图1B和1D）10。为了形象化轴突的预测，在图1B和1D的图像被暴露在胞体的区域过度曝光高层次。一个暴露的较低水平（图1E）显示，表达GFP的细胞体确实本地化嗅球（比较图1C及1E;灰线，标志着嗅球边境）。 图1。针对性的5 DPF的斑马鱼胚胎的嗅球GFP的表达。 ET（zic4：Gal4TA4，无人机：mCherry）hzm5转基因增强子陷阱线，显示构mCherry表达在后脑，小脑，前脑和嗅球（A和 C，mCherry荧光显示为红色）。这mCherry表达介导的转基因Gal4的表达。胚胎已与UAS – GFP的表达载体，电穿孔28 HPF，显示绿色荧光蛋白的表达有针对性的在受精后5天的嗅球（B，D，和 E，绿色荧光绿色显示相同的胚胎，并在A C）。一个曝光的图片的底部（e）显示，GFP的表达是有限的嗅球细胞机构。灰线表示嗅球的边界。明场（灰度），绿色荧光（绿色），和红色荧光（红色）图像都是用Olympus BX60荧光显微镜。