La préparation de la souris crémaster pour l'imagerie intravitale de la microcirculation

1. Souris bord, socle musculaire, le coin le corps et la solution de surfusion Souris bord: Un rectangulaire transparente en plexiglas conseil d'administration (6 "de large X 8" long X 3 / 16 "d'épaisseur) est fait pour tenir sur la scène du microscope L'." Conseil de la souris "est l'endroit où la souris anesthésiée est garanti lors de la préparation chirurgicale des le muscle crémaster. Piédestal musculaire: Un socle en caoutchouc transparent silastic est préparé à partir Sylgard 184, qui est mélangé selon les instructions du · Producteur s. Un moule commode est un 15 mm d'épaisseur x 50 mm de diamètre de diamètre jetables boîte de Petri. Le bloc Sylgard est coupé à la forme souhaitée avec une lame de rasoir (voir figure 1C).. Une fine couche de colle silicone transparent imperméable est utilisé pour sécuriser le bloc Sylgard au conseil d'administration de la souris. Conseils utiles: Après avoir versé le Sylgard dans la boîte de Pétri, de dégazage dans une chambre à vide pendant une heure, élimine les bulles d'air et améliore la clarté. Après dégazage, le temps de durcissement pour les Sylgard est raccourcie en plaçant le plat dans un four de laboratoire à 50 ° C pendant plusieurs heures. Wedge Corps et plate-forme de chauffage: Un coin (2 "x 4" x 15 °) placé sous la souris et contre le socle incline le corps vers l'avant qui facilite l'extension du muscle crémaster sur le socle de son origine. Intégrer une plateforme en aluminium sur la surface permet de chaleur par conduction. La plate-forme est chauffé par des résistances liées à une alimentation DC (figure 1A). Calibrage de la température de la plate-forme à ~ 40 ° C maintient la température de l'œsophage à ~ 37 ° C. Sinon, la chaleur rayonnante d'une lampe est utilisée. Pins. Pour sécuriser le crémaster sur le piédestal, les broches sont préparés à partir de 0,15 mm broches insectes qui ont été pliées en "L". Solution salée physiologique (PSS). Les préparatifs sont perfusées (irrigué) en continu avec du bicarbonate tamponné PSS préparés ultrapure (18,2 MQ) H 2 O. Les solutions mères sont préparées à la concentration de travail finale 20X et stérilisée à travers un filtre de 0,2 um. Les solutions mères restent bonnes pendant plusieurs semaines s'il est conservé à 4 ° C. Préparation des sels séparément du bicarbonate et de les mélanger avec la dilution sur le jour de l'expérience empêche la précipitation du bicarbonate de calcium. La solution de sel d'actions est composé de (en mmol / L): 2638 de NaCl, KCl 94, 40 MgS0 4, 23,4 CaCl 2. Le bicarbonate de stock est de 360 NaHCO 3. Le jour de l'expérience, les solutions respectives sont portées à un volume final (typiquement 2 L pour une expérience donnée) dans une fiole jaugée et placé dans un bain d'eau à ~ 37 ° C. Équilibrant le PSS avec 5% de CO 2 / 95% N 2 pour ~ 15 minutes à l'aide d'un disperseur de gaz ajuste le pH à 7,4 ~ et empêche la précipitation. Le PSS fait barboter en permanence avec 5% de CO 2 / 95% N 2 tout au long des expériences. La composition de la solution finale de travail (en mmol / L) est: 132 NaCl, KCl 4,7, 1,2 MgS0 4, 2 CaCl 2, 18 NaHCO3. 2. Anesthésie et préparation à la chirurgie Suite à l'approbation de l'Institutional Animal Care et du Comité utilisation, la souris mâle au moins 12 semaines sont utilisées. La souris est anesthésiés avec du pentobarbital sodique (60 mg / kg) par voie intrapéritonéale (IP) d'injection. Un tube de retenue s'avère utile pour la sécurisation de la souris lors de l'injection initiale. Tout au long des procédures chirurgicales et des protocoles expérimentaux, l'anesthésie est maintenue par des suppléments (10-20% de l'injection initiale, ip) comme il faut (toutes les 30-60 minutes; indiqué par réaction de retrait à l'orteil ou de pincer la queue). Astuce: La dilution du pentobarbital 10 mg / ml dans une solution saline stérile avant l'injection réduit la possibilité d'un surdosage. Anesthésie compromis régulation de la température afin de la souris doit être gardé au chaud immédiatement après la première injection. Placer la souris dans un support métallique (saladier en aluminium ventilé) sur le dessus d'une plaque chauffante (calibré à ~ 37 ° C) fonctionne bien. Alternativement, une lampe de chaleur peut être utilisée en prenant soin de le positionner à une distance appropriée de la souris. La souris doit être surveillée toutes les 5-10 minutes jusqu'à ce que le niveau approprié de l'anesthésie est réalisée (manque de retrait à l'orteil ou de pincer la queue). Une dose supplémentaire peut être nécessaire après 15-20 minutes. Il est préférable d'être patient et procéder avec prudence pour éviter un surdosage, en particulier avec les animaux obèses ou âgés. Le poil est retiré de l'abdomen, le bas du dos, le scrotum et les jambes en prenant soin rasage régions respectives. Une attention particulière doit être prise pour éviter un traumatisme au scrotum et les testicules qui, autrement, blesser le muscle crémaster. Enlever les poils lâche avec une compresse imbibée d'alcool frais. Si la vessie est pleine il se sentira comme un petit raisin à travers la paroi abdominale. Vider la vessie en utilisant une pression douce pour éviter la souris d'uriner sur la préparation crémaster pendant les expériences. Un Kimwipe est une éponge effet aux collectionst l'urine. Placez la souris sur le dos, couché sur le coin avec ses jambes à cheval sur le piédestal. Une suture de soie (4-0 ou 5-0) lié à chaque pied donne une attache pour fixer la souris avec son entrejambe contre le piédestal. Un morceau de ruban adhésif placé sur la poitrine vaguement et sécurisé au coin maintient la position générale du corps. Les interventions chirurgicales sont effectuées lors de la visualisation à travers une loupe binoculaire avec des ciseaux et des pinces à angle microdissection. 3. Préparation chirurgicale du muscle crémaster ouverte Une broche est placée par le sommet du sac scrotal (soit le côté droit ou gauche) et fixée dans le socle pour placer la tension sur la peau. Superfusion avec PSS (34-35 ° C) est lancé sur le champ opératoire et maintenues pendant toute la dissection de garder les tissus exposés au chaud et humide. Une mèche (fait à partir Kimwipe) placé à une extrémité à côté du scrotum et l'autre à côté d'une ligne sous vide enlève le PSS effluents. Un cordon de mastic silicone adhéré au Conseil de plexiglas et encerclant complètement le coin et socle sert de "fossés" pour collecter les PSS qui n'est pas aspirée, servant une précaution efficace pour empêcher la fuite PSS sur le microscope. Une incision est faite le long de la surface ventrale du sac scrotal. Si le testicule a été escamotée par le muscle crémaster dans la cavité abdominale, une légère pression sur le bas-ventre dirige le testicule dans le sac. La surface du muscle crémaster recouvrant le testicule doit être identifié à ce moment. Le tissu conjonctif entre la peau du scrotum et le muscle crémaster est soigneusement enlevé pour libérer le muscle crémaster du tissu environnant. La peau du scrotum est légèrement rétracté derrière le bord proximal du piédestal et sécurisé de chaque côté avec une épingle. La surface extérieure de la surface du muscle crémaster est alors débarrassée des tissus conjonctifs. Surfusion continue pendant hydrates de dissection du tissu conjonctif, ce qui facilite la visibilité et l'enlèvement. Une épingle à travers l'apex du crémaster est utilisé pour le placer sous tension longitudinale. Une incision longitudinale est faite à travers la surface ventrale du muscle avec grand soin pour minimiser la perturbation de la vascularisation. Dynamique de l'écoulement de sang près de la périphérie de la préparation sont modifiés par la présente 14 dommages aux tissus. Par conséquent, pour minimiser ces effets sur la collecte de données, les vaisseaux sanguins à proximité du centre de la préparation sont utilisés pour l'imagerie et des études physiologiques. Le muscle crémaster est relié par un ligament mince pour l'épididyme sous le testicule. Reflétant le testicule d'un côté expose ce ligament, qui est soigneusement séparée de l'épididyme. Près de la pointe du muscle crémaster est petite artère et une veine qui le relient à l'épididyme. Occlusion de ces vaisseaux entre les forceps et les tirant minimise les saignements. Le testicule, épididyme, artère et veine testiculaire sont ligués proximale (4-0 ou 5-0 suture de soie), coupé et jeté (orchidectomie) avec le coussinet adipeux inguinale associée. Alternativement, le testicule peut être doucement repoussée dans la cavité abdominale et conservé avec un morceau de coton ou Kimwipe. L'orchidectomie sert à éviter les traumatismes possibles au tissu en poussant les testicules dans la cavité abdominale. Nous n'avons pas trouvé de différences notables dans la qualité de la préparation microcirculation crémaster (voir section 3.8) en utilisant soit la procédure 7,15. La surface externe du muscle crémaster est effacé du tissu conjonctif reste et s'est ensuite propagée radialement sur la surface du piédestal. Les bords sont sécurisés avec des épingles (voir section 1.4) en 5-6 endroits pour créer une feuille plane de muscle strié avec la microcirculation intacte. La préparation terminée est transféré à la platine d'un microscope intravitale, perfusées en continu (3-5 ml / min, 34 ° C) et équilibrée pendant 30 minutes. Intégrité de la préparation crémaster est évaluée selon plusieurs critères. Vasomotricité spontanée avec un traumatisme chirurgical minimale est indiquée par un écoulement rapide dans les artérioles et le manque de leucocytes adhérents dans les veinules. L'indice le plus sensible d'une préparation de réactif est la constriction des artérioles à élever la teneur en oxygène surfusion solution pendant 5-10 minutes. Cela se fait par l'équilibration avec 21% d'O 2 (vs 5% d'O 2, voir la section 1.5, tous avec 5% de CO 2, l'équilibre de N 2). La présence de leucocytes dans les artérioles, l'absence de globules rouges circulant dans les capillaires, et / ou les leucocytes s'accumulent dans les veinules et des tissus environnants sont des signes de lésions tissulaires et l'inflammation. 4. Imagerie intravitale de la microcirculation du muscle crémaster Intravitale imagerie est réalisée sur un microscope personnalisée basée sur une plate-forme Olympus MVX10 zoom stéréo. Le corps de microscope MVX10est monté sur un véhicule hybride MVX10 stand équipé avec transillumination (lampe halogène) pour fond clair (Köhler) d'imagerie et d'épi-illumination (lampe à mercure) pour l'imagerie de fluorescence. L'aide d'Epi-illumination, GCaMP2 est excité à 472/30 nm avec une émission recueillies à 520/35 nm. Les images sont acquises à travers une lentille MT PLAPO 2XC (ouverture numérique = 0,50; Olympus) en utilisant une caméra numérique XR/Mega-10 intensifié (Stanford Photonics, Inc SPI) via logiciel de contrôle Piper (SPI) sur un ordinateur personnel. Avec ce système, le champ observé de vue (FOV) peut varier de 553 um X 442 um à 22 mm X 18 mm. À la fin des expériences d'imagerie intravitale, la souris anesthésiée est euthanasié à une surdose de pentobarbital suivie par dislocation cervicale. 5. Les résultats représentatifs Conseil d'administration de la souris la figure 1. Pour l'imagerie intravitale de la préparation de la souris crémaster. A) coin du corps avec la plate-forme en aluminium (isolé avec du plastique jaune) vu par le bas. Résistances de chauffage fixé à la face inférieure de la plate-forme de fournir de la chaleur menée. B) La plate-forme de chauffage repose sur une cale en plastique. C) Le coin corps est placé sur une planche de plexiglas pour la chirurgie et de son transfert ultérieur à l'étape du microscope intravitale. Piédestal Sylgard est indiqué avec une flèche rouge. Un cordon de silicone étanche entoure toute la préparation pour contenir toute solution qui peut fuir pendant la procédure intravitale, l'empêchant de couler sur le microscope. Figure 2. Microscope à champ large Macrozoom personnalisé pour l'imagerie. A) MVX10 corps du microscope (Olympus) avec la caméra ICCD XR/Mega-10 (Stanford Photonics) monté sur le port trinoculaire. B) Gros plan sur le corps du microscope. (A) le contrôle de zoom (0,63 à 6,3 x), (b) roue à filtres; l'image (c) doubleur (NA = 0,50 avec un grossissement optique 25x). Condenseur de la C) pour fond clair (Köhler) éclairage (Condenseur NA = 0,55, distance de travail = 27 mm). Figure 3. Terminé la souris crémaster préparation. La souris anesthésiés en décubitus dorsal sur la plateforme en aluminium recouvert de plastique chaud (jaune). La position du corps est sécurisé avec du ruban adhésif. Le muscle crémaster est réparti radialement sur le piédestal du caoutchouc silastic transparent et épinglé sur les bords. Solution de surfusion est introduit à l'extrémité proximale par un goutteur en plastique (flèche blanche). Une ligne vide (tête de flèche blanche) élimine la solution via une mèche Kimwipe. Deux micropipettes sont montrés positionnés avec leurs conseils dans le tissu. Une électrode de référence (fil d'argent) est fixé sur le bord inférieur du muscle crémaster. Figure 4. Illustrant la plage de grossissement pour la visualisation des réseaux artériolaires exprimer GCaMP2 dans l'endothélium. A) fluorescent et B) l'image prise à fond clair grossissement optique 3,2 X de un grossissement total = 42X sur le moniteur vidéo. [Champ de vision (FOV) = 4375 x 3470 um]. Barre d'échelle = 500 pm. Travailler à ce grossissement facilite le placement des micropipettes aux endroits voulus. C) fluorescent et D) l'image prise à fond clair grossissement optique de 6.4X pour le grossissement total = 83X (FOV = 2200 x 1759 m). Barre d'échelle = 200 pm. E) fluorescent et F) l'image prise à fond clair grossissement optique de 12.6X pour grossissement total = 165X (FOV = 1100 x 885 um). Barre d'échelle = 100 pm. G) avec doubleur de l'image, grossissement optique = 25.2X. Barre d'échelle = 50 microns.