الجراحية زرع الخلايا الجذعية العصبية الماوس في النخاع الشوكي لفئران مصابة موجه للعصب الماوس فيروس التهاب الكبد
Summary
هو مفصل في زرع الخلايا الجذعية العصبية (NSCs) في النخاع الشوكي للفئران مع إزالة الميالين المعمول بها. إعداد NSCs ، هي الخطوط العريضة لاستئصال الصفيحه من الفقرات الصدرية 9 (T9) ، وزرع NSCs جنبا إلى جنب مع الرعاية قبل وبعد العملية ، من الفئران.
Abstract
فئران مصابة بسلالة فيروس موجه للعصب JHM التهاب الكبد الماوس (MHV) وضع النتائج المرضية والسريرية للمرضى مماثلة مع مرض التصلب المتعدد المزيل (MS). وقد أظهرت لنا أن زرع NSCs في النخاع الشوكي للمريض في الفئران النتائج تحسنا كبيرا في كل من وعودة الميالين في نتائج سريرية. العلاجات البديلة للخلايا لعلاج الأمراض العصبية المزمنة أصبحت الآن حقيقة واقعة في النماذج الحية والحيوية في فهم التفاعلات بين الخلايا المضيفة المكروية engrafted والأنسجة. هذا العرض يوفر وسيلة لزرع الخلايا تتكيف في النخاع الشوكي للفئران المصابة JHMV. باختصار ، نحن نقدم لإجراء ط) إعداد NSCs قبل الزرع ، والثاني) قبل العملية الرعاية من الفئران ، والثالث) تعرض الحبل الشوكي من خلال الثقب ، والرابع) من حقن المجسم NSCs ، والرابع) الرعاية اللاحقة للعمليات الجراحية .
Protocol
Discussion
وسوف تنفذ جيدا زرع يتوقف في المقام الأول على استئصال الصفيحه الحذر وحقن الخلايا. في شرك الأولية لتجنب خلال الثقب هو إلحاق أضرار في الحبل الشوكي. وهذا يمكن أن تحدث أثناء العملية نفسها أو الأضرار الناجمة عن شظايا عظام حادة تركوها وراءهم بعد الإجراء. لتجنب هذه ، تأكد من أن نقطة من المقص الصغير منحني تواجه دائما بعيدا عن الحبل وتدرس بعناية laminectomized العمود الفقري لضمان أن يتم مسح جميع شظايا العظام والتي تبقى العمود الفقري لهيكل لا يملك جاحظ علنا أو خشنة الحواف.
كما ذكر سابقا ، فإن الكشف عن هروب رأس المال إذا كان من الممكن على ضوء مشرقة زاهية ومباشرة على تعرض النخاع الشوكي أثناء الحقن. هروب رأس المال هو ما سيحدث على الأرجح مع الإبر قياس 30 (مقابل 33 مقياس) وإذا تم حقن بسرعة كبيرة. رغم أن هذا البروتوكول قد أعطانا نتائج جيدة ، وأفاد آخرون ينتظرون فترات طويلة (تصل إلى 5 دقائق) قبل حقن ابرة التراجع 8،9 التالية. أيضا ، والإبر أصغر قياس هي الأفضل ، لكننا لاحظنا أن يتم بسهولة lysed بعض الخلايا عند تمرير عن طريق إبر عيار 33.
لتعظيم الكفاءة ، وفريق زرع يحرسون مراكز الأربعة المختلفة (الماوس الإعدادية ، الثقب ، والحقن ، وخيوط) أمر مرغوب فيه. وعلاوة على ذلك ، ينبغي أن يكون الأمثل لتوقيت كل إجراء لتقليل الوقت الخلايا ينتظرون على الجليد. على سبيل المثال ، ونحن لدينا زرع الفئران في مجموعات من أربعة (عدد الجرعات في كل حمولة من الحقنة) ، والشخص حقن الخلايا يبدأ تحميل محقنة بعد laminectomized الماوس الشخص الثالث واعداد الفئران يجب تخدير التالية وقد laminectomized المجموعة بعد الماوس الثانية من المجموعة السابقة. بهذه الطريقة ، يمكننا زرع الخلايا (أو وسائط التحكم) إلى 40 في الفئران نحو 3 ساعات على الرغم من كل الماوس سيستغرق 30-40 دقيقة تقريبا.
العلاجات البديلة للخلايا لعلاج بعض اضطرابات الجهاز العصبي المركزي في الوقت الراهن 10 في التجارب السريرية. ليس هناك بديل عن النماذج الحية في زرع مجلس الأمن القومي وبروتوكول لدينا من engraftment NSCs في النخاع الشوكي للفئران مع إزالة الميالين يسببها فيروس يسهل استخدام نموذجا هاما للماجستير ويمكن أيضا أن تتكيف بسهولة مع نماذج أخرى.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Materials
| Name of the reagent/equipment | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
|---|---|---|---|
| Ketaject | Phoenix Parmaceuticals | NDC 57319-542-02 | |
| Xylazine Hydrochloride | MP Biomedicals | 158307 | |
| Nair | Church & Dwight Co. | ||
| 10μl Hamilton Syringe w/ Removable needle | Hamilton Company | 7635-01 | |
| Hamilton Needles, 30G or 33 G, ½ inch, 30° bevel | Hamilton Company | 7803-077803-05 | Test the viability of your cells following passage through needles to identify the best gauge to use |
| Micro Scissors | World Precision Instruments | 555500S | |
| Small Graefe Forceps | FST | 11053-10 | |
| Stereotaxic | KOPF Instruments | Model 1772 Universal Holder | |
| Stereotaxic | KOPF Instruments | Model 1773 Electrode Holder | |
| Stereotaxic | KOPF Instruments | Model 902 small animal stereotaxic | |
| Stereotaxic | KOPF Instruments | Model 960 left electrode carrier | |
| Sutures | Ethicon | 95057-064 | |
| Lactated Ringers | Hospira | NDC 0409-7953-03 | |
| Staples | Fine Science | 12032-07 | |
| Hemostat | FST | 13010-12 | |
| Scalpels, sizes 10,11 | Fisher | 268878, 268879 | |
| Sutures | ETHICON | 1676G | size 5-0, 3/8″ circle, 19mm needle, 45cm braided thread |
| Reflex 7 wound clip applicator | FST | 12031-07 | |
| 7mm Reflex wound clips | FST | 12032-07 | |
| Olsen-Hegar needle holder | FST | 12502-12 |
References
- Bergmann, C. C., Lane, T. E., Stohlman, S. A. Coronavirus infection of the central nervous system: host-virus stand-off. Nat Rev Microbiol. 4, 121-132 (2006).
- Weiner, H. L. The challenge of multiple sclerosis: how do we cure a chronic heterogeneous disease. Ann Neurol. 65, 239-248 (2009).
- Fleming, J. O., Trousdale, M. D., Bradbury, J., Stohlman, S. A., Weiner, L. P. Experimental demyelination induced by coronavirus JHM (MHV-4): molecular identification of a viral determinant of paralytic disease. Microb Pathog. 3, 9-20 (1987).
- Totoiu, M. O., Nistor, G. I., Lane, T. E., Keirstead, H. S. Remyelination, axonal sparing, and locomotor recovery following transplantation of glial-committed progenitor cells into the MHV model of multiple sclerosis. Exp Neurol. 187, 254-265 (2004).
- Carbajal, K. S., Schaumburg, C., Strieter, R., Kane, J., Lane, T. E. Migration of engrafted neural stem cells is mediated by CXCL12 signaling through CXCR4 in a viral model of multiple sclerosis. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 11068-11073 (2010).
- Hardison, J. L., Nistor, G., Gonzalez, R., Keirstead, H. S., Lane, T. E. Transplantation of glial-committed progenitor cells into a viral model of multiple sclerosis induces remyelination in the absence of an attenuated inflammatory response. Exp Neurol. 197, 420-429 (2006).
- Blakemore, W. F., Crang, A. J. . Transplantation of glial cells into areas of demyelination in the adult rat spinal cord. , (1992).
- Liu, S. Embryonic stem cells differentiate into oligodendrocytes and myelinate in culture and after spinal cord transplantation. Proc Natl Acad Sci U S A. 97, 6126-6131 (2000).
- Keirstead, H. S. Human embryonic stem cell-derived oligodendrocyte progenitor cell transplants remyelinate and restore locomotion after spinal cord injury. J Neurosci. 25, 4694-4705 (2005).
- Mayor, S. First patient enters trial to test safety of stem cells in spinal injury. BMJ. 341, c5724-c5724 (2010).
