Mozaïek Analyse van Gene Functie in Postnatale Mouse ontwikkeling van de hersenen met behulp van Virus-based Cre recombinatie
Summary
Een<em> In vivo</em> Methode om gen-functie te testen in postnatale hersenen wordt beschreven. Recombinant AAVs uiten Cre-en / of een fluorescerend eiwit wordt geïnjecteerd in neonatale hersenen van muizen. Mozaïek gen inactivatie en schaars neuronale etikettering worden bereikt, waardoor een snelle analyse van de genfunctie in processen van cruciaal belang voor neurale circuit ontwikkeling.
Abstract
Een normale hersenfunctie vertrouwt niet alleen op de embryonale ontwikkeling als de belangrijkste neuronale paden zijn gevestigd, maar ook op de postnatale ontwikkeling bij het neurale circuits zijn gerijpt en verfijnd. Misregulation in dit stadium kan leiden tot neurologische en psychiatrische aandoeningen zoals autisme en schizofrenie 1,2. Veel genen zijn onderzocht in de prenatale hersenen en vond cruciaal belang voor vele ontwikkelingsprocessen 3-5. Echter, hun functie in de postnatale hersenen is grotendeels onbekend, mede omdat hun verwijdering in muizen leidt vaak tot sterfte tijdens de neonatale ontwikkeling, en deels omdat hun eis in de vroege ontwikkeling belemmert de postnatale analyse. Om deze obstakels, worden floxed allelen van deze genen op dit moment geproduceerd in muizen 6. In combinatie met transgene allelen die uitdrukken Cre recombinase in specifieke celtypen, voorwaardelijke verwijdering kan worden bereikt om gen-functie in de postnatale hersenen te bestuderen. Echter, deze methode vereist bijkomende allelen en extra tijd (3-6 maanden) voor het genereren van de muizen met de juiste genotypen, waardoor het beperken van de uitbreiding van de genetische analyse van een grote schaal in de hersenen van muizen.
Hier laten we zien een complementaire aanpak die viraal geuit Cre gebruikt om deze floxed allelen bestuderen snel en systematisch in postnatale ontwikkeling van de hersenen. Door het injecteren van recombinant adeno-geassocieerde virussen (rAAVs) 7,8 codering Cre in de neonatale hersenen, we zijn in staat om het gen van interesse in de verschillende gebieden van de hersenen te verwijderen. Door het beheersen van de virale titer en coexpressing een fluorescerend eiwit marker, kunnen we tegelijkertijd realiseren mozaïek-gen inactivatie en spaarzame neuronale etikettering. Deze methode omzeilt de eis van vele genen in de vroege ontwikkeling, en stelt ons in staat om te studeren hun cel autonome functie in een groot aantal kritische processen in de postnatale ontwikkeling van de hersenen, waaronder axonale en dendritische groei, vertakkingen, en tegels, maar ook synapsvorming en verfijning. Deze methode is met succes gebruikt in onze eigen lab (niet gepubliceerde resultaten) en anderen 8,9, en kan worden uitgebreid tot andere virussen, zoals lentivirus 9, evenals voor de uitdrukking van shRNA of dominante actieve eiwitten 10. Bovendien, door het combineren van deze techniek met de elektrofysiologie, alsook recent ontwikkelde optische beeldvorming tools 11, deze methode zorgt voor een nieuwe strategie om te onderzoeken hoe genetische pathways invloed neurale circuit de ontwikkeling en functie in muizen en ratten.
Protocol
Discussion
De neonatale virale injectiemethode hier wordt gepresenteerd biedt een eenvoudige en snelle manier voor het genereren van in vivo mozaïeken voor de studie van postnatale ontwikkeling van de hersenen. De methode maakt gebruik van floxed allelen die momenteel beschikbaar zijn en als die worden gedaan via de High Throughput Gene Targeting project 6. In vergelijking met het gebruik van transgene expressie van Cre, deze methode biedt een snelle manier om genfunctie in verschillende celtypen te testen, al…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk wordt ondersteund door een RO1 subsidie van NIH (NINDS).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
|---|---|---|---|
| rAAV8-Cre, -GFP, -DsRed, | Vector Biolabs | #7060, #7061, custom order | http://www.vectorbiolabs.com |
| Harvard Pump 11 Plus | Harvard Apparatus | #702208 | (No foot pedal port) |
| Retinal Pigment Epithelium Injection Kit | World Precision Instruments | RPE-KIT | Contains connective tubing, injection needles (36G), and needle holder |
| NanoFil Syringe, 100μl | World Precision Instruments | NANOFIL-100 | Includes reusable loading needle |
| D-PBS | Invitrogen | 14040-117 | |
| GFP antibody | Aves | GFP-1020 | |
| DsRed antibody | Clontech | 632496 | |
| Heating Block | VWR | 97042-610 | |
| ROSA26R mouse | Jackson Laboratory | 003309 |
References
- Geschwind, D. H., Levitt, P. Autism spectrum disorders: developmental disconnection syndromes. Curr Opin Neurobiol. 17, 103-111 (2007).
- Giedd, J. N., Rapoport, J. L. Structural MRI of pediatric brain development: what have we learned and where are we going?. Neuron. 67, 728-734 (2010).
- Chedotal, A., Richards, L. J. Wiring the brain: the biology of neuronal guidance. Cold Spring Harb Perspect Biol. 2, (2010).
- Shen, K., Cowan, C. W. Guidance molecules in synapse formation and plasticity. Cold Spring Harb Perspect Biol. 2, (2010).
- Chen, S. Y., Cheng, H. J. Functions of axon guidance molecules in synapse formation. Curr Opin Neurobiol. 19, 471-478 (2009).
- Guan, C., Ye, C., Yang, X., Gao, J. A review of current large-scale mouse knockout efforts. Genesis. 48, 73-85 (2010).
- Tenenbaum, L. Recombinant AAV-mediated gene delivery to the central nervous system. J Gene Med. 6, 212-222 (2004).
- Broekman, M. L., Comer, L. A., Hyman, B. T., Sena-Esteves, M. Adeno-associated virus vectors serotyped with AAV8 capsid are more efficient than AAV-1 or -2 serotypes for widespread gene delivery to the neonatal mouse brain. Neuroscience. 138, 501-510 (2006).
- Pilpel, N., Landeck, N., Klugmann, M., Seeburg, P. H., Schwarz, M. K. Rapid reproducible transduction of select forebrain regions by targeted recombinant virus injection into the neonatal mouse brain. J Neurosci Methods. 182, 55-63 (2009).
- Szulc, J., Aebischer, P. Conditional gene expression and knockdown using lentivirus vectors encoding shRNA. Methods Mol Biol. 434, 291-309 (2008).
- Pan, F., Gan, W. B. Two-photon imaging of dendritic spine development in the mouse cortex. Dev Neurobiol. 68, 771-778 (2008).
- Soriano, P. Generalized lacZ expression with the ROSA26 Cre reporter strain. Nat Genet. 21, 70-701 (1999).
- Madisen, L. A robust and high-throughput Cre reporting and characterization system for the whole mouse brain. Nat Neurosci. 13, 133-1340 (2010).
- Tong, C., Li, P., Wu, N. L., Yan, Y., Ying, Q. L. Production of p53 gene knockout rats by homologous recombination in embryonic stem cells. Nature. 467, 211-213 (2010).
