使用实时活体成像在肿瘤纳米粒子吸收的评价

1。肿瘤接种到禽流胚胎的CAM 准备受精的鸡胚胎壳的说明 8 。 胚胎发育的第9天，组装微量进样器使用的是18号到1 mL注射器针头连接。剪下一块聚乙烯管（1 / 32“内径3 / 32”外径，1 / 32“壁厚）5-6英寸和仔细的油管插入针头斜面。大约4-5英寸的油管延长从针尖（图1a）。 细胞悬液填充注射器和油管。然后，一个显微注射玻璃针管端插入，并仔细清除任何气泡。 清扫范围与照明10,000-100,000癌细胞作为CAM（图1c）内的丸注入日，根据9个胚胎（图1b）。慢慢注入细胞，并仔细确保针在正确的地方为细胞内形成一个可见的CAM丸。凸轮表面上的滴水使用Kimwipe或其他撒施，可清洗的细胞。 返回胚胎培养箱在38℃，湿度在60％，并允许肿瘤生长和血管（7天）。 2。纳米粒子的制备为了准备注射到鸡胚胎CPMV纳米粒子的荧光标记;淡化（合成为8 PBS，pH值7.4，前一分钟的使用和离心机，以消除任何浓度100微克/毫升的旋涡混合的病毒粒子。根据共轭和聚集程度，也可能是有用的集合体。超声荧光标记的CPMVs存货至少1年的稳定存储在4 ° C黑暗环境中检查周期性地把一对夫妇的股票跌落到载玻片荧光检查。透射电子显微镜（TEM）也可以被用来确定颗粒保持完好后，共轭。 简言之，一微克的病毒粒子（在最后的2μL卷），可以添加到镀铜电网。接下来，添加等体积1分钟在电子显微镜（飞利浦EM 410）2％醋酸铀。 3。静脉注射病毒荧光标记的纳米粒子 16日，组装微量进样器，如上面所述。通过到注射器管（> 200μL）绘制所需的病毒纳米粒子的体积。小心地取出任何气泡。显微注射玻璃针管端插入。确保针只要尽可能的锥形（图2a）。如果针头太钝，它不会被皮尔斯能够通过外胚层，将无法穿透血管。如果针头太锋利，针尖穿透组织时就会崩溃。 静脉注射注入荷瘤胚胎从远端所需的站点100μL1毫克/毫升荧光右旋糖酐（MW 70000大，Invitrogen公司），可视化（图3d）。成功的CAM静脉插管是显而易见的，清除血液中注射流的路径（图2b）。评估后注射血管渗漏1小时。 静脉注射注入胚胎含有肿瘤血管渗漏所需的站点从远端CPMV的Alexa Fluor 647（647 CPMV – AF）或聚乙二醇CPMV的Alexa Fluor 647（CPMV – PEG – 647自动对焦）为1 mg / ml的溶液50μL可视化。 影像肿瘤立即和每一个小时后注射使用蔡司主任Z1与横河电机的旋转盘，滨松IMAGEM 9100-12 EM – CCD摄像头直立显微镜安装。 4。实时活体成像要组装的胚胎成像单元，应用胚胎成像单元的盖子底面周长成像端口周围薄薄的一层真空润滑脂，适合到端口18毫米的玻璃盖玻片。 盖玻片盖成像所需的区域位置的胚胎。慢慢放下盖子，直到盖玻片与胚胎接触，然后再拧上盖子的单位举行的地方（图2c）。 将水加热至37 ° C到外面的菜含有胚胎的胚胎成像单元，然后放到一个堂堂正正的共聚焦显微镜的阶段与整个单位的内部环境室平衡至37 ° C。 位置成像装置，旋转盘共聚焦荧光显微镜（图2E）含有胚胎。成像装置将举行到位的胚胎，并保持固定拍摄图像时的视野，从而为立体ž堆栈和时间推移图像被捕获。我们采集和分析时间推移三维图像，使用Perkin Elmer公司（前身为即兴）Volocity软件包（图3a）。采集的肿瘤高分辨率三维堆叠和周围血管可视化detaile在特定时间点的三维结构分析。收购定期的时间点的三维堆叠地图详细的结构变化，在肿瘤血管。每隔一小时注射后的图像肿瘤。 病毒粒子的摄取定量计算平均值的Alexa Fluor（AF）的647在肿瘤或基质（非肿瘤区）的形象，如Volocity定量分析软件（Perkin Elmer公司）在选定区域内的信号。肿瘤基质的比例计算，除以平均AF 647基质的信号平均AF 647在肿瘤的信号。肿瘤/间质比高于1，表示正在采取由肿瘤的纳米颗粒。 5。代表性的成果： 在这里所描述的例子，我们注入了HT – 29结肠癌细胞内形成一个约1mm大小的丸9天鸡胚胎（图1b）的凸轮。接种后，胚胎培养在培养箱7天，以允许足够的肿瘤生长和血管生成（图1c）。胚胎与低分子右旋糖酐静脉注射，以确认肿瘤血管生成，肿瘤蔡司AxioExaminer Z1直立显微镜（图2d）下的可视化。 （图3a和b）经静脉给药CPMV – 647自动对焦或CPMV PEG -自动对焦647纳米粒子，高清晰度的实时共焦成像（图2E）透露，CPMV和CPMV – PEG纳米颗粒迅速标记整个血管，但CPMV – PEG肿瘤摄取比CPMV高出约3倍，在12小时后（图3a）。纳米粒子的相对肿瘤摄取确定使用图像分析软件（Perkin Elmer公司Volocity）。选择感兴趣区域内部和外部的肿瘤（基质车厢），平均每个荧光强度测定。数据表示为肿瘤/间质比。 图1。肿瘤微量注射禽流胚胎的凸轮。 （一）显微注射器具是从组件组装表示。 （二）在9天的禽流感胚胎准备与肿瘤接种当凸轮已经蔓延到覆盖整个表面。 （c）在第16天，将有成长为肿瘤直径在1厘米（虚线），并准备注入纳米粒子。 图2纳米粒子注射液和活体成像。注射显示显微镜下解剖（一）微量注射器针头尖端的CAM静脉注入（二）微量注射器针头插入静脉（箭头表示）和纳米粒子注射到血流（通过清除看到血）。 （三）成像单元含盖玻片直接与CAM接口禽流胚胎。 （四）纳米粒子注射之前，评估肿瘤血管生成是使用荧光右旋糖酐注射后的活体成像。 （E）成像单元含有胚胎定位，内温度调节的外壳设置一个堂堂正正的共聚焦显微镜阶段至37 ° C 图3纳米粒子吸收在人类肿瘤的活体可视化。 7小时后注射（一）CPMV – AF647及（b）CPMV PEG – AF647肿瘤可视化。 D）切除肿瘤禽流胚胎以供后续分析。