Оценка наночастиц в опухоли в реальном времени с помощью Прижизненные изображения

1. Прививка от опухоли в CAM птичьего эмбриона Подготовка оболочки менее оплодотворенных эмбрионов куриных, как описано 8. На 9-й день эмбрионального развития, собрать микро-инжектор использованием 18-иглы подключены на 1 мл шприца. Вырезать 5-6 дюймов кусок Tygon трубки (1 / 32 "внутренний диаметр, 3 / 32" наружный диаметр, 1 / 32 "толщина стенки) и аккуратно вставьте скос иглы в трубку. Примерно 4-5 дюймов трубки должны простираются от кончика иглы (рис. 1а). Заполните шприц и трубку с клеточной суспензии. Затем вставьте иглу микроинъекции стекла в конце трубы и тщательно удалить пузырьки воздуха. Inject День 9 эмбрионов (рис. 1б) при вскрытии прицел с подсветкой с 10000-100000 раковые клетки в виде болюса в течение CAM (рис. 1в). Медленно вводить клетки и тщательно обеспечить, чтобы игла находится в правильном месте для клеток для формирования видимых болюсно в CAM. Клетки, которые капать на поверхность CAM можно чистить с помощью Kimwipe или других аппликатора. Вернуться эмбрионов увлажненный инкубаторе при температуре 38 ° С при влажности 60% и позволяет опухоли расти и vascularize (до 7 дней). 2. Подготовка наночастиц Для подготовки флуоресцентно меченных CPMV наночастиц для введения в куриный эмбрион, разбавленный вирусных наночастиц (синтезируется как в 8 в PBS, рН 7,4, до концентрации 100 мкг / мл смеси Vortex задолго до того, использование и центрифуги в течение одной минуты, чтобы удалить. агрегатов. ультразвука также может быть полезна в зависимости от конъюгатов и степени агрегации. Запасы флуоресцентно меченных CPMVs стабильны в течение не менее 1 года при условии хранения при 4 ° С в темноте. Проверьте запасы периодически, поставив пару капель на предметное стекло и проверка флуоресценции. просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ) также может быть использован для определения того, частицы остались нетронутыми после сопряжения. Короче говоря, один микрограмм вирусных наночастиц (в конечном объеме 2 мкл) могут быть добавлены к медным покрытием сетки. Затем добавьте равный объем 2% уранилацетата в течение 1 минуты на электронном микроскопе (Philips EM 410). 3. Внутривенное введение флуоресцентно меченных вирусных наночастиц На 16 день, сборки микро-инжектор, как описано выше. Составление требуемого объема вирусных наночастиц через шланг в шприц (> 200 мкл). Осторожно удалите воздушные пузырьки. Вставьте иглу микроинъекции стекла в конце трубы. Убедитесь, что игла тех пор, и конические, насколько возможно (рис. 2а). Если игла слишком тупой, он не сможет проникнуть через эктодермы и не сможет проникнуть в судно. Если игла слишком острым, кончик рухнет, когда проникающая ткани. Внутривенно вводят по 100 мкл 1 мг / мл флуоресцеина декстрана (70000 МВт Да, Invitrogen) в опухоли эмбриона подшипников дистальнее нужный сайт для визуализации (рис. 3). Успешная катетеризация вены CAM видно по очистке крови в пути инъекции потока (рис. 2б). Оценка сосудистой утечки через 1 час после инъекции. Внутривенно вводят 50 мкл 1 мг / мл раствора CPMV-Alexa Fluor 647 (CPMV-AF 647) или пегилированного CPMV-Alexa Fluor 647 (CPMV-ПЭГ-AF 647) в эмбрионы содержащие опухоли с сосудистой утечки дистальных от желаемого сайта быть визуализированы. Изображение опухоли сразу и каждый час после инъекции использованием Zeiss Ревизора Z1 прямой микроскоп оснащен диском Yokogawa спиннинг, Хамамацу ImagEM 9100-12 EM-CCD камерой. 4. В реальном времени прижизненной визуализации Чтобы собрать блок эмбриона изображений, нанесите тонкий слой вакуумной смазки по окружности изображений порта на нижней крышке устройства визуализации эмбриона, и соответствовать 18 мм стекло покровное на порт. Позиция эмбриона, что покровное будет охватывать требуемую область для работы с изображениями. Медленно опустите крышку, пока покровное просто вступает в контакт с эмбриона, а затем винтовой крышкой на единицу, чтобы удерживать его на месте (рис. 2). Добавить воды, нагретой до 37 ° С в блок визуализации эмбриона вне блюдо с эмбриона, а затем поместить весь блок на сцену вертикально конфокальной микроскопии с внутренней экологической камеры доведены до 37 ° C. Установите копи содержащие эмбриона под вращающийся диск конфокальной микроскопии флуоресценции (рис. 2е). Копи проведет эмбриона на месте и держать в поле зрения фиксированной во время захвата изображения, позволяющий как для трехмерных стеков Z и покадровой изображения, которые будут захвачены в плен. Мы приобретаем и анализа трехмерных покадровой изображения с помощью Перкин Элмер (ранее импровизация) Volocity пакет программного обеспечения (рис. 3а). Приобретать высоким разрешением трехмерные стопки опухоли и окружающих сосудистой визуализировать detaileг структурного анализа в определенных временных точках. Приобретать трехмерных стеков в основное время, указывает на карте подробные структурные изменения в сосудистую сеть опухоли. Изображение опухоли каждый час после инъекции. Количественного поглощения вирусных наночастиц рассчитать среднее Alexa Fluor (AF) 647 сигнала в отдельных регионах в опухоли или в строме (неопухолевой область) с использованием образа программного обеспечения, таких как количественный Volocity (Perkin Elmer). Опухоли стромы соотношение было рассчитывается путем деления средней AF 647 сигнал в опухоли на длине AF 647 сигналов в строму. Опухоль / стромы соотношение выше, чем 1 указывает, что наночастицы, рассматриваемых опухоли. 5. Представитель результаты: В примере, описанном здесь, мы вводили HT-29 клетки рака толстой кишки в форме болюса примерно 1 мм размера в течение CAM дня 9 куриных эмбрионов (рис. 1b). После прививки, эмбрионы культивировали в течение 7 дней в увлажненном инкубаторе разрешить достаточный рост опухоли и васкуляризации (рис. 1в). Эмбрионы вводили внутривенно с низким молекулярным весом декстран для подтверждения васкуляризации опухоли и опухоли были визуализированы под Zeiss AxioExaminer Z1 прямой микроскоп (рис. 2г). После внутривенного введения CPMV-AF 647 или CPMV-ПЭГ-AF 647 наночастиц (рис. 3а, б) высокого разрешения в режиме реального времени конфокальной микроскопии (рис. 2е) показало, что оба CPMV и CPMV-ПЭГ наночастицы быстро помечены всей сосудистой сети, но поглощение CPMV-ПЭГ на опухоль была примерно в 3 раза выше, чем CPMV после 12 часов (рис. 3а). Относительное поглощение наночастиц опухоли определяли с помощью анализа изображений программное обеспечение (Volocity от Perkin Elmer). Интересующие регионы были выбраны в пределах и за пределами опухоли (в стромальных ящиком) и средняя интенсивность флуоресценции каждого был определен. Данные выражается как опухоль / стромы отношение. Рисунок 1. Микроинъекция опухолей в CAM от птичьего эмбриона. () Микроинъекции аппарат собирается из компонентов, как указано. (Б) Птичий эмбрионов на 9-й день готовы к засевают опухоли, когда CAM распространился, чтобы покрыть всю поверхность. (С) На 16-й день, опухоль вырастет до до 1 см в диаметре (пунктирная линия) и готов к инъекции наночастиц. Рисунок 2. Инъекции наночастиц и прижизненной визуализации. Инъекция под рассечение микроскопа () кончик иглы microinjector готовы быть введен в вену CAM и (б) иглы microinjector вставляется в вену (указано стрелкой) и наночастиц вводят в кровоток (если смотреть в безналичном крови). (С) изображений единица, содержащая птичьего эмбриона с покровным сопряжены непосредственно с CAM. (Г) До наночастиц инъекции, васкуляризация опухоли оценивается с помощью прижизненного изображения после введения флуоресцеина декстран. (Е) изображений единица, содержащая эмбрион расположен на этапе вертикально конфокальной микроскопии в пределах температуры регулируемой набора корпуса до 37 ° C. Рисунок 3. Прижизненное визуализации наночастиц в опухолях человека. Опухоли визуализируются 7 часов после инъекции () CPMV-AF647 и (б) CPMV-ПЭГ-AF647. г) Иссечение опухоли от птичьего эмбриона для последующего анализа.