Détermination des structures moléculaires des glycoprotéines d'enveloppe du VIH en utilisant microscopie cryo-électronique et automatisée Sous-tomogramme moyenne

L'approche décrite ici a été développé en utilisant un ensemble précis d'instruments, outils et logiciels. Parce que tous les laboratoires ne seront pas utiliser cette même configuration expérimentale, l'effort a été fait pour généraliser l'approche de la mesure du possible, et proposer des alternatives lorsque cela n'était pas possible. 1. Préparation des échantillons du virus vitrifiés Dans la section suivante grilles vitrifiés sont préparés en utilisant la FEI Vitrobot Mark III, un robot plonge buvard et la congélation. Voir Iancu, et al. Pour un protocole détaillé sur l'utilisation de ce système 7. Comme alternative à un plongeur robotique, un plongeur guillotine style ou la gravité est parfaitement suffisant 6. Dans les sections 1.2. et 1.3. une unité de 950 Gatan solarus décharge luminescente est utilisé pour nettoyer les grilles de l'échantillon et d'augmenter leur hydrophilie, si aucun dispositif de décharge luminescente conçu pour une utilisation avec des grilles de microscopie électronique peut être remplacé. contenu "> Bien que le montant du volume d'échantillon appliquée à la grille avant de tamponner et de congélation doit être plonger dans la gamme de 2 pl, le virus et la protéine A l'or colloïdal volume dans le mélange de l'échantillon varie selon la source. En tant que tel, il est probable que toute une gamme de dilutions de virus et de l'or ou des ratios devront être testés et imagé dans le microscope, et un mélange idéal déterminé de manière empirique. Notez que lorsque les données d'image est acquise à la section 3, entre 10 et 20 d'or marqueurs fiduciaires doivent être présents pour l'alignement d'inclinaison série correcte. Attention: Cette section décrit l'utilisation de l'éthane gazeux, l'hydrogène et l'oxygène qui sont hautement inflammables. Une bonne précaution devraient être prises lors de l'utilisation de ces gaz. De plus, les soins devraient être prises pour manipuler des échantillons du virus conformément aux recommandations de biosécurité. Enfin, toujours porter des lunettes et vêtements de protection lors de la manipulation d'azote liquide (N 2) et d'éthane. Préparer FEI Vitrobot MarkIII en tournant sur ​​son approvisionnement en gaz de N 2, l'installation de la cartouche humidificateur puis remplissage de la cartouche avec de l'eau déminéralisée filtrée. Puissance sur le Vitrobot et définir sa température de la chambre climatique à 22 ° C, humidité cible à 100%, le temps de buvard à 6 sec, et éponger compensée à -2 mm. Puissance sur le Gatan solarus 950 unités décharge luminescente et ouvert de H 2 et O 2 bidons que l'approvisionnement de l'unité. Chambre de spécimens pré-nettoyage en exécutant une décharge luminescente pendant 1 min à 50 Watts. Disposez le nombre souhaité de grilles de carbone troué sur une lamelle de verre, de carbone secondaires en place, et placer dans la chambre à décharge luminescente spécimens à travers la porte de chargement supérieure. Nettoyer les grilles en exécutant une décharge luminescente pour les 6-10 sec à 25 Watts. (Notez que le côté de carbone de la marque de grilles Quantifoil utilisé dans ce protocole sont en apparence mate. Ce ne sera pas vrai pour toutes les grilles commerciales il est donc préférable d'obtenir cette information auprès du fabricant.) Placez la boîte de grille (s) à l'intérieur COOun bol contenant Lant, et la broche diffuseur thermique sur la coupe centrale qui se trouve dans le bol de liquide de refroidissement. Versez lentement l'azote liquide dans le bol 2 jusqu'à ce que l'bouillonnement vigoureux, indiquant l'équilibre entre la cuvette et liquide. Maintenir l'azote liquide de niveau 2 dans le reste de la procédure, en prenant soin de le garder hors de la coupe centrale. Fixez une extrémité d'un tuyau en plastique à la bonbonne de gaz éthane et l'autre extrémité à une pipette en verre. Tenir la pointe de pipette en verre au fond de la tasse de centrales, d'établir un processus lent, le flux d'éthane stables, et l'éthane va commencer à condensation. Continuer à remplir jusqu'à la Coupe du centre est plein. Retirer la broche de la Coupe du central. Préparer le mélange de l'échantillon en ajoutant deux protéines-A uL d'or colloïdal repères à 10 uL AT-2 inactivé le VIH-1 suspension de virus. Délicatement la pipette mélange d'apporter repères dans la solution. Restez sur la glace. Saisir le bord extérieur d'une grille avec les brucelles spécialisées Vitrobot. Appliquer 2 pl de mélange de l'échantillon de carbone side de la grille. Donner immédiatement des instructions du robot pour charger l'échantillon en chambre climatique humidifié, épongez et congelez plonger dans l'éthane liquide. Transfert de grille vitrifiés à la boîte de grille. Répétez l'étape 1.7. pour produire le nombre souhaité de grilles. Lorsque vous avez terminé, serrer les vis sur le couvercle de la boîte de grille (s), puis transférer rapidement case (s) à de petites azote liquide transports Dewar. 2. Chargement dans des échantillons au microscope électronique à transmission Tout au long de cette section, le liquide de N 2 niveau dans la chambre de chargement doivent être surveillés avec vigilance, et le liquide réapprovisionnés selon les besoins, afin de s'assurer que les boîtes de grille reste immergé. Avant de mettre un outil en contact avec une grille, le refroidir en la plongeant dans l'azote liquide 2 jusqu'à ce qu'il s'équilibre avec le liquide. Après chaque utilisation, les outils doivent être décongelés en utilisant un pistolet à air chaud. Tout au long de cette section de la FEI Tecnai G2 Polara Microscope électronique à transmission (MET) est utilisé en conjonctionavec un poste de travail Gatan Cryo. Alors que le principe de chargement des échantillons dans l'azote liquide 2 conditions sont applicables à tous les travaux de microscopie cryo-électronique, les étapes de cette section sont spécifiques à l'équipement utilisé dans l'expérience. Les étapes utilisées pour les différents équipements varie selon le fabricant. ATTENTION: Dans cette section, toujours porter des lunettes et vêtements de protection lors de la manipulation de liquide de N 2. Assurez-vous que Compustage TEM ne contient pas une cartouche échantillon, et que la sélection et l'insertion spécimen tige tige sont en dessous de 110 K. Refroidir et préparer Workstation Cryo pour le chargement des grilles dans le bloc de stockage des échantillons, qui fait partie de la tige de sélection de l'échantillon. Transfert de la tige de sélection refroidie (<110 K) de microscope pour Cryo Workstation. Tige sélection glisser vers l'avant pour insérer bloc de sélection dans le bain d'azote sur les stations de travail Cryo. Retirez toutes les cartouches spécimen de bloc de stockage à l'aide spécialisée cartridge de manipulation des forceps. Placez la boîte de grille (s) poste de travail dans le chargement et desserrer le couvercle (s) avec un tournevis. Utilisez une pince à épiler pour enlever la grille de la boîte de grille et placer dans un cartouche. Utilisez l'outil de placement spécialisé C-clip pour déposer un C-clip sur le dessus de la grille, la sécurisation du réseau dans la cartouche. Répétez l'étape 2.5. jusqu'au nombre désiré de grilles sont dans les cartouches. Transfert cartouches de bloquer la sélection des échantillons. Préparer Workstation Cryo pour l'enlèvement de la tige de sélection des échantillons. Glissez la tige de sélection Retour pour enlever bloc de sélection du bain d'azote. Retirer la tige de sélection Workstation Cryo et joindre à TEM. 3. L'acquisition de données de microscopie cryo-électronique Durant cette section, l'interface du logiciel Batch FEI tomographie est utilisée pour mettre en place un fichier batch qui stocke les coordonnées de tous les postes du réseau d'intérêt. Lorsque demandé par l'utilisateur, le logiciel de tomographie par lots réexaminera chacune des positions et coordonneral'acquisition par l'intermédiaire d'inclinaison séries Micrograph numérique. Si ce logiciel n'est pas disponible, le logiciel est viable Leginon libre, open source alternatifs 13. Imaging a été fait à 200 keV, en utilisant une imagerie Gatan filtre (GIF) avec un post-GIF 2K x 2K caméra CCD (Gatan). Compustage position telle que par faisceau d'électrons passe à travers vide. Passer en mode agrandissement de l'exposition élevée (34kX) et effectuer des alignements directs. Aligner à zéro pic de perte sur l'énergie du filtre. (Cette offre le filtre d'énergie avec une référence pour les électrons avec zéro perte d'énergie.) Déplacez le Compustage à une zone de grille avec du carbone. Dans un faible grossissement (4.5kX) Mode de recherche, utilisez la fonction Wobbler pour incliner le stade va et vient entre + / -15 °. En attendant de régler la position stade de l'axe Z jusqu'à ce stade de changement minimal est observé. (Cette position le stade peu près à hauteur eucentrique). Désactiver Wobbler quand aucun changement scène est observée. Utilisez la hauteur f automatisé eucentrique l'onction d'affiner la hauteur eucentrique. (Cette routine utilise la corrélation croisée pour obtenir une hauteur plus précis que dans eucentrique étape 3.3). Hauteur eucentrique est automatiquement enregistrée pour référence ultérieure par le logiciel de tomographie par lots. Trouver une zone d'intérêt avec environ trois à six virions, et pas moins de dix marqueurs fiduciaires. Ajouter cette position sur la grille dans le fichier de la tomographie par lot. Répétez les étapes 3.4. et 3.5. jusqu'au nombre souhaité de postes sont désignés. Définir les paramètres par lots (± 60 ° avec 2 tranches inclinable ·, 1-2 e-/ A 2 / Vue d'inclinaison) et exécuter le batch. 4. Reconstruire cryo-électronique tomogrammes Aligner séries d'inclinaison à l'aide automatique de repères à base d'alignement dans RAPTOR 1. Reconstruire tomogrammes utilisant le R-pondérée de projection de retour dans IMOD 8. Le format de fichier standard pour les volumes de données qui en résulte est le fichier MRC, avec extension de fichier. MRC. ve_title "> 5. pointes Segmentation sous-volumes virion et l'identification Cette section utilise une extension personnalisée de IMOD qui permet à l'utilisateur de désigner des sous-volumes au sein du virion tomogramme. Dans la section 6, l'utilisateur définit des limites du virion sont utilisés comme surface le long de laquelle les pics sont automatiquement sélectionnés. Ouvrez IMOD et charger un tomogramme peuplé de virions. Naviguer le long de la Z-axe de la tomographie jusqu'à la tranche de centrale à travers l'un des virions est situé. Vérifiez que le barycentre du virion a été identifié. Après cela, déposer un marqueur de virion. Ce marqueur sera utilisé par l'utilitaire de segmentation automatisée du virion à la section 6. Continuez jusqu'à ce que tous désignation centroïde volumes virion sont identifiés. Fermer et enregistrer tomogramme mis marqueur définissant centroïdes virion. Répétez jusqu'à ce que les virions ont été désignés dans tous les tomographies. Utiliser IMOD, subtomograms virion bas-échantillon par un facteur de quatre. Virions Denoise utilisant bord améliorant la diffusion anisotrope telle que transposée dans IMOD. Sous réserve de la segmentation des virions de membrane non supervisée utilisant une énergie basée sur l'approche en trois dimensions (détaillés dans Bartesaghi et al. 2005) 3. Spikes sont identifiés à des endroits sur la surface du virion segmentée correspondant à des maxima locaux de la corrélation croisée entre le lieu particulier et une synthèse symétriques épi volume. Ceux emplacements ci-dessus d'un seuil spécifié sont ajoutés à une liste de coordonnées pour les sous-volumes pic putatifs. 6. Classification et la moyenne des particules Extraire les calculs sous-volumes tomogramme (100 x 100 x 100 voxels) à chaque endroit qui a été identifié à l'étape 5.8. (Cela se fait sans débruitage ou binning). La collection résultante de sous-volumes contiennent des protéines pic qui sera classé et moyenne dans les étapes suivantes. Déterminer les orientations de l'axe long de la pointe à l'aide de la normale à la membrane segmentée automatiquement à l'emplacement de chaque épi. Cette approche fournit des estimations initiales de deux des trois angles d'Euler. Randomize restant en place une rotation pour éviter tout biais possible dans les alignements ultérieurs. Appliquer les angles d'Euler aux sous-volumes, puis aligner les sous-volumes translation à leur moyenne mondiale cylindrique en moyenne afin de s'assurer qu'ils partagent tous le même centre de masse. Enlevez les 10% de sous-volumes qui sont en corrélation plus mal avec la moyenne mondiale actualisée. Ceci est fait pour éliminer les densités les plus à risque d'être identifiée par erreur pointes. Aligner et classer les volumes pic sans utiliser des références externes et à la comptabilité appropriée du coin manquant (détaillées dans Bartesaghi et al. 2008) 4. D'affiner progressivement les alignements sous-volume et de classer les volumes de pointe à chaque itération. Trois-symétrie doit être clairement observé dans les premiers stades de la classification et à la quatrième itération, 3-symétrie est imposée. A chaque tour, la plupart des classes bien définies sont moyennées et utilisées comme référence pour le prochain tour. Typiquement ~ 4000 pointes devraient être sélectionnés pour chaque ensemble de données. Cartes de densité finale est obtenue après tours ~ 5-12 et le raffinement comprendra des contributions de ~ 50% de sous-volumes dans chaque dataset. 7. Coordonner montage Les cartes de densité résultant de 6,8 étape sont ouverts dans l'UCSF Chimera 12. Produire une simulation de 20 une carte de la X-ray à l'aide des coordonnées chimère ou RESE 10. Dock coordonnées dans des orientations aléatoires. Utiliser Chimère construite en plus raide ascension-optimisation locale, l'ajustement des coordonnées en effectuant des multiples de 100 marches plus grande pente jusqu'à convergence est obtenue. 8. Les résultats représentatifs En utilisant la moyenne 3D et de coordonner de montage, une variété de VIH et SIV Env structures pic ont été résolus. Présenté à la figure 3A est la structure de la flambée des enveloppes de la souche VIH-1, Bal (violet). Le pic a trois symétrie avec des dimensions de 120 Å ~ telle que mesurée à partir de la membrane à l'apex pointe, et une largeur maximale de ~ 150 Å qui s'effile vers ~ 35 Å à la base de l'épi. Comme le montre la figure 3B, en combinant la carte de densité pour les trimérique Env déterminée par cryo-tomographie électronique avec la structure cristallographique déterminé pour monomérique gp120 (rouge, dérivé de l'APB ID, 2NY7), nous avons été en mesure d'obtenir un modèle de travail moléculaires pour la trimérique complexes glycoprotéine d'enveloppe (APB ID, 3DNN) 9. Notre approche permet également de l'analyse structurale des complexes formés entre trimérique Env et une variété de gp120 protéine spécifiquedes fragments et des anticorps. Un exemple de cela, dans laquelle Env est complexé avec le Fab neutralisants B12 est montré dans la figure 4A (le complexe est en violet). Dans cette figure, la densité supplémentaire correspondant à b12 est vu saillie vers l'extérieur de la pointe, et parallèlement à la membrane. Interprétations structurales de ces complexes peut être étendue à l'échelle moléculaire en équipant les cartes de densité avec des coordonnées atomiques pour des parties de la pointe, lié au ligand correspondant. Comme le montre la figure 4B, lorsque cette carte de la densité est équipé de coordonnées de la protéine gp120 pic (rouge, dérivé de l'APB ID, 2NY7) lié par Fab b12 (blanc), les orientations relatives des trois carottes de la gp120 peut être discerné (APB ID, 3DNL). Ces relations de conformation sont instructives pour comprendre comment de tels ligands interagissent avec le pic et interférer avec l'activité des virus. Quelques autres structures de unliganded et ligandé Env qui ont été résolus par la méthode présentée ici inclusude ceux de VIH-1 R3A, SIV CP-MAC, et SIVmneE11S SIVmac239, le complexe ternaire entre le VIH-1 Env Bal, sCD4 et la Fab 17b, et SIV Mac ​​CP-Env complexé à l'anticorps 7D3 9,14. Figure 1 A partir de la suspension virale à structure 3D:. Étapes conceptuelles en cryo-microscopie électronique et reconstruction 3D. Figure 2 (A). Une tranche représentant d'une tomographie du VIH-1 virions. (B) Un seul VIH-1 virion, avec des pointes de base et la surface représentée schématiquement. La figure 3 (A). Structure tridimensionnelle de la glycoprotéine d'enveloppe du VIH-1 Bal (pointes de surface) tel qu'il apparaît sur ​​la surface de la membrane virale. (B) Le modèle moléculaire pour la trimepointes ric déterminée en plaçant trois copies de la gp120 monomérique structures pour (rouge), tirés par cristallographie aux rayons X dans la densité carte 9. Figure 4 (A). Structure tridimensionnelle du VIH-1 glycoprotéine d'enveloppe Bal en complexe avec le fragment Fab d'un anticorps neutralisants, B12. (B) Le modèle moléculaire pour le complexe déterminée en plaçant trois copies de la gp120 monomérique structures complexes Fab-B12 obtenues par cristallographie aux rayons X dans la densité carte 9.