В естественных условиях лазерной Axotomy на языке C. Элеганс

1. Сборка системы Конкретных компонентов нашей системы, изложены ниже. При правильно собранный, пользователь должен иметь возможность сосредоточиться микроскоп с одной стороны, двигаться на одной сцене с другими (либо с помощью мыши или джойстика), включите лазер с ножной педалью, и имеют четкое представление о на- изображения на экране. Micropoint лазер установлен на эпи-флуоресценции порт соединения микроскопа. Мы используем Nikon 80i, но каких-либо исследований класса вертикальном или перевернутом сфера должна работать. Система Micropoint будет включать в себя пользовательские дихроичных, который должен соответствовать флуорофора, что метки клетки вы хотите вырезать. Резка клетки помечены альтернативных флуорофоров требует дополнительных dichroics. Кроме того, генератор импульсов и ножной педали поставляются с системой Micropoint. 100x, 1,4 Н. А. нефти цель для выполнения операций и оценки регенерации, а также дополнительные задачи, необходимые для размещения образца на слайд. Мы используем план Nikon Apo VC для хирургии, и обнаружили, что 4x полезно для грубой фокусировки и нахождение образца. Моторизованный сцене с помощью джойстика. Сцену с чрезвычайно высокой точности и повторяемости не потребуется, так этапе используется только для ориентации. Мы используем До OptiScan II (см. обсуждение). Камера. Камера должна обеспечивать достаточную частоту кадров, чтобы сосредоточиться и целевой меченых аксонов с 100x цель, в то время визуализации изображения на мониторе компьютера. Мы предпочитаем ослабления освещения свет в течение axotomy процедуры, чтобы избежать возможных вмешивающихся эффектов от фото-отбеливание или повреждение (см. п. 1.7, ниже). Таким образом, камера должна быть достаточно чувствительным, чтобы приспособить этот сниженный уровень света. Мы используем Хамамацу Orca 05G, и обнаружили, что изображения на 16,3 Гц достаточно. Эквивалентный камер может быть заменен. Компьютер, монитор и обработки изображений, которые могут управлять камерой. Кроме того, мы используем для обработки изображений для управления моторизованным сцене с мышью (см. обсуждение). Воздух таблице. Это требование может изменяться в зависимости от местоположения, но так как операция проводится с целью 100x, мы находим виброизоляции необходимым. Свет питания с световод и механизм затвора для освещения флуорофора. Световод будет приложить к Micropoint. Механизм затвора, полезно уменьшить интенсивность освещения независимо от лазера. Мы используем До Lumen 200 или Leica EL6000, и затухают до 80% от полной интенсивности света для axotomy. 2. Лазерная установка Подробный протокол на начальном этапе согласования и фокусировки лазерного снабжен лазерной системы Micropoint. Будем считать, что процедура была успешно следуют при первоначальной настройке. Это включает в себя выравнивание лазера с перекрестием в окуляр. Здесь мы предлагаем протокол для регулярного технического обслуживания в фокусе лазера и интенсивности. Как отмечается в руководстве Micropoint, импульсный азотный лазер способный серьезный ущерб человеческому глазу. Следует проявлять осторожность, чтобы никогда не смотреть прямо на лазерный луч. После установки, барьер фильтр должен безопасно блок излучения через окуляры. Резка нейроны в организме размером с песчинку может оказаться непростой задачей. Поскольку площадь урон, наносимый лазерным очень мало, важно знать, трехмерное расположение в фокусе лазера с целью выявить и образец точно. Лазерной внимание найти с помощью слайд зеркальные. Во-первых, мы проверяем, что место г лазерного фокуса матчей фокус изображения путем. Далее, расположение ху ущерба внимание отмеченные в перекрестье обработки изображений. Фокусировка в г-плоскости Нажмите на фильтр нейтральной плотности ND16 (рис. 1а). Мы используем фильтры нейтральной плотности в эпи-освещения пути для ослабления лазерного время фокусировки. Для еще более тонкую фокусировку, толчок в обоих ND16 и ND4 флуоресцентных фильтров. Установить Micropoint лазерного импульса с 1 переключатель обратился к "Выбрать" (рис. 1б), а затем переместите фильтр колесо, чтобы соответствующие долгосрочные пройти барьер фильтра (рис. 1в). Место слайд продублированы на этапе и сосредоточить внимание на отверстия в нем с 4-кратным цель использования проходящем свете. Добавить каплю иммерсионного масла на слайд зеркальные и переориентировать на прокол с 100X цели. Откройте затвор камеры с оптического пути переключения рычага (рис. 1, г), а затвор лазер (рис. 1д). При необходимости уменьшить интенсивность проходящего света так краев отверстий четкие: это поможет при фокусировке точно. Пресс ножной педали. Это должно производить небольшое отверстие в зеркало, если лазер фокусируется. Фокус микроскопом чуть выше плоскости слайд зеркальных и стрелять лазерным снова. Это должно сделать еще меньшедыре, чем первый выстрел, или не оставляют след на всех. Повторите, сосредоточив внимание ниже слайд зеркально. Если отверстие не производится в 2.5, или если большое отверстие производится при фокусировке выше или ниже поверхности зеркала, переориентировать лазер с кольца фокусировки на абляции голову. Убедитесь, что отверстие до сих пор должным образом увязаны с перекрестием в окуляр. При постоянном использовании, г-плоскости фокуса редко нуждается в корректировке. Сосредоточение в плоскости ху Выполните шаги 2,1 через 2,3 выше и нажмите педаль, чтобы сделать небольшое отверстие в зеркале слайда. Инициировать "Live" режим съемки из "приобретает" Элементы меню. В "мера" панели инструментов выберите "ROI редактора, затем выберите инструмент« двойной крест »и перетащите перекрестье чтобы увязать их с центром новое отверстие. Нажмите кнопку "Сохранить рентабельность", затем "Выход редактора и возобновить Живая режим съемки. Активировать настройки "мышь XY 'в элементах манипулировать этапе с помощью мыши. Вытяните фильтр нейтральной плотности (ы) обратно в исходное положение (ы), набор лазерных импульсов до 10, и удалить слайд зеркально. Регулировка мощности лазера Мощность лазера должна быть скорректирована на минимальной мощности, необходимой, чтобы сократить нейрона на ваш выбор. Отрегулируйте мощность, перемещая пластину аттенюатора (рис. 1е) при одновременном сокращении жизни червей (см. ниже). Если мощность лазера слишком высока, то это вызовет периферического повреждения или взрыва отверстие в червя. Если мощность лазера слишком низкий, это не будет разрывать нейрона. После того как система была создана, положение аттенюатора редко нуждается в изменении. Если лазер становится слабым, и пластина аттенюатор должен быть перемещен продолжать резки, это может быть признаком того, что краситель краситель клетка должна быть заменена (см. обсуждение). 3. Остановите червей Приготовить раствор из 3% расплавленной агарозы в M9 (22 мм КН2РО4, 42мм Na2HPO4, 85 мм NaCl, 1 мМ MgSO 4). Внесите 5 мл расплавленной агарозы в 15 мл трубки сокола. Заполните другая труба с водой. Место труб в модульной нагревательный элемент установлен в 55 ° C. Заполните нагревательный элемент с водой для создания мини-ванны воды для каждой трубки. Примечание: агарозном могут быть подготовлены в большом количестве заранее и повторно расплавленного для последующих экспериментов. Поместите два слоя маркировки ленты на каждом из двух слайдов и чистый слайд между этими слайдами. Внесите капли агарозы использованием пластиковой пипетки лампы до середины чистой слайдов и место другой слайд перпендикулярно к первой, так что в результате агарозном подушка толщиной два куска ленты (рис. 2). Удалите одну из двух слайдов с площадки через 30 секунд. Промыть и хранить пластиковые пипетки в заполненном водой сокола трубки для использования с последующим слайдов. Далее, поместите 3-5 мкл 0,10 мкм или 0,05 мкм бисера полистирола в центре площадки. Добавить 5-10 червей выражения флуоресцентного белка в нейронах интерес. Если нейронов, представляющих интерес, асимметрично распределенные на правую или левую сторону червя, использование платины выбрать, чтобы перевернуть червей, так что правильный лицевой стороной вверх. Черви должны быть помещены на слайдах в течение 10 минут подготовки агарозном колодки. Осторожно установите крышку поскользнуться на червей. После размещения покровным стеклом, не двигайте его относительно агарозном площадку так как это нарушит кутикулы и уничтожать червей. Место подготовлено слайд на предметный столик микроскопа. 4. Вырезать нейронов Прямой свет в окуляр с оптическим рычагом переключения пути. Сосредоточьтесь на червя быть сокращены с 4-кратным цели, месту каплю масла на крышке скольжения, и переключиться на 100X цели. Вернуться оптический путь к камере. Используйте мышь для перемещения нейронов на ваш выбор в центре перекрестия. Пресс педаль стрелять лазером и разорвать нейронов процесса. При необходимости, два набора импульсов может быть использован для разорвать нейрона. Сначала, полезно отслеживать, какие именно нейроны были разорваны в отдельных червей для оценки последующей регенерации. При правильном выполнении лазерной axotomy производит небольшой перерыв в нейрон, не причинив существенного вреда окружающим тканям кожи или других нейронов (см. рисунок 3). В некоторых случаях небольшой шрам может формироваться вокруг места повреждения. Восстановление червей, удаляя покрытие скольжения в прямое движение вверх, стараясь, что черви остаются на площадке агарозы. НЕ слайд покровное прочь. Затем вырезать площадку вокруг черви с иглы нос щипцами и место раздела агарозы на недавно посеяны NGM пластины, содержащей OP50 8. Место 10 мкл стерильной M9 на площадку, чтобы освободить червей из бисера и удаления агарозы. 5. Оценка для регенерации нейронов Подготовка площадки агарозы как указано в пункте 2.2. Место червей в 3-5 иму, L полистирола бисером. Применить покровное. Слайды могут быть подготовлены последовательно, или же все черви могут быть подготовлены заранее и слайды хранятся в 10 см культуры блюд, каждое из которых содержит влажной Kimwipe держать влажной агарозы. Используйте 100X цель визуализировать разорвала нейронов. Во многих нейронов, нейронных пень дистальнее места среза останется. Мы используем наличие этого остатка, как признак того, что нейрон действительно разорваны (рис. 4). Наличие этого пень позволяет отличить нейрона, разрезанные и регенерируется от одной, которая была не вырезано. Обратите внимание: и дистальных и проксимальных пни изначально отказаться после того, как разрез. Оценка регенерации. Различных параметров может быть определена. Один простой анализ, является ли пострадавший нейрон сформировал роста конуса (рис. 4а) и повторно, или нет (рис. 4б). Кроме того, длина аксонов можно проследить и сравнить. 6. Представитель результаты В качестве примера, мы опишем характеристики регенерации γ-аминомасляной кислоты (ГАМК) моторных нейронов. Эти нейроны, которые находятся в брюшной нервной и расширить процессы окружности к грудной отдел спинного мозга нервы, имеют важное значение для правильного передвижения 9. ГАМК-нейроны могут быть визуализированы, выразив генетически закодированы флуорофора, такие как зеленый флуоресцентный белок (GFP), под контролем UNC -47 или -25 UNC промоутеров (штаммы EG1285 и CZ1200, соответственно, можно получить генетический центр Элеганс C. ). Горы L4 стадии червей, как описано, флип-червей так ГАМК нейроны на своей правой стороны вверх, и место покровное стекло. Вырезать 1-3 из задней спайки в каждом червя, на полпути между спинной и брюшной шнуры. Избегайте резки спайки, которые пересекают или расположенный пучком с другими спайки, так как их трудно забить позже. Восстановление червей, как описано. От 18 до 24 часов после успешной axotomy, черви оправились от операции и проявляют нормальной двигательной и кладка яиц поведения. Отменить червей, которых мертвыми или больными. Установите на остальные, как описано, и оценить регенерации. Мы обычно целью оценить не менее 30 вырезать нейронов в экспериментальных условиях. В oxIs12 животных, как правило, 60-70% из отрубленных L4 ГАМК нейронов будет инициировали структуры роста конуса, о чем свидетельствует расширение мембраны на кончике и расширение ряда отраслей аксонов, а мигрировали из места среза (рис. 4а). Во многих случаях рост конусы мигрировали воссоединиться с грудной отдел спинного мозга нервы, соседних нейронов спайки, или дистальной культи. Остальные 30% нейронов придется либо инициировал никакого роста, формирования культи проксимального на сайт axotomy, или будут иметь расширенные лишь небольшие филоподий (рис. 4б). Рисунок 1. УФ импульсного лазера axotomy системы. Конкретные компоненты: (а) ND фильтры (б) импульса селектор (в) фильтр рычаг колеса (г) оптического пути переключения рычаг (е) лазерного затвора и (е) аттенюатор пластины. Рисунок 2. Подготовка площадки агарозы. Чтобы подготовить площадку агарозы из нужной толщины, два слоя ленты (зеленый) размещаются на двух слайдах. Слайд находится между первыми двумя, и капли агарозы затем добавляется к чистой слайда. Наконец, четвертый слайд помещается перпендикулярно к первым трем, что приводит к площадке, которая толщиной два куска ленты. Рисунок 3. Представитель ГАМК нейронов axotomies. В типичном эксперименте, ГАМК нейронов спайки порваны в середине наружной стороны червя. Разорвала спайки показан непосредственно перед (слева) и после (справа) axotomy. Все снимки были сделаны с целью 100X нефти. Рисунок 4. Представитель результаты ГАМК axotomies нейрона. 24 часа после axotomy разорвала аксоны забил для регенерации. Аксон регенерирующий с ростом конуса (стрелка) показана на (), тогда как не-регенерирующий аксон рассматривается как проксимальная культя (стрелка) в (б). Дистальной культи каждого разреза аксон показан на каждой панели (стрелки) и является признаком того, что аксон был разорван.