Procedura per l'Ingegneria del polmone

1. Bioreattore Assemblea Figura dettagliate (s) del bioreattore progettazione e montaggio sia per decellularization e la cultura sono forniti nelle figure 1 e 2, rispettivamente. Tutti i componenti devono essere sterilizzati prima del montaggio del bioreattore. I seguenti punti specifici sono indicati: COLLEGAMENTI: La cannula arteriosa è costituito da un raccordo luer-lock collegato ad un Y-splitter da un breve segmento di tubo. Il connettore luer-lock è collegato al tubo di perfusione, e il segmento del cromosoma Y che non è suturato l'arteria polmonare è collegato a una valvola unidirezionale. La valvola unidirezionale è orientato in modo che il liquido può essere redatto nel tubo (nella direzione opposta di perfusione), ma durante la perfusione degli organi tutti fluido scorre nei polmoni. La cannula tracheale è composto anche di un connettore luer-lock collegato a un Y-splitter con tubi. Il luer-lock si connette a un circuito respiratorio tra il serbatoio trachea e la camera principale. Il segmento del connettore a Y che non è suturato alla trachea è anche collegato ad una valvola unidirezionale. La valvola unidirezionale è orientata nello stesso modo come la cannula arteriosa. FUNZIONI: Il senso unico valvole nella cannule arteriose e tracheale sono utilizzati per eliminare le bolle d'aria nel tubo, consentendo l'inversione del flusso nei tubi e quindi permettendo bolle d'aria da rimuovere. Il "circuito respiratorio" comprende due valvole unidirezionali, posizionati in modo tale che la media segue un percorso diverso dentro e fuori del polmone. Una descrizione più dettagliata di questa funzione è disponibile in una pubblicazione preventiva da parte i nostri 2 di laboratorio. Perfusione vascolare è fornito utilizzando una pompa a rulli. Medium è perfuso in arteria polmonare attraverso la cannula collegata, scorre attraverso il sistema vascolare polmonare, e la vena polmonare direttamente nel bioreattore principale, dove è tratto medio per perfusione. 2. Organ Harvest Euthanize adulti (3-6 mesi) Fischer 344 ratti per overdose di sodio pentobarbital, secondo le linee guida stabilite dalla American Veterinary Medical Association (60 mg / kg IP). Nota: la soluzione di pentobarbital include eparina a 100 unità / ml per la terapia anticoagulante. Spray o pulire il torace e dell'addome con il 70% di etanolo. Aprire la cavità toracica, esponendo il cuore ei polmoni, avendo cura di non danneggiare i polmoni. Cura fare una piccola finestra attraverso il diaframma nella cavità toracica, provocando i polmoni di ritrattare, e quindi espandere questa incisione orizzontale per esporre le basi dei polmoni. Fare due incisioni verticalmente attraverso le costole, e ritirare la gabbia toracica per esporre il cuore ei polmoni. Preparare un sistema di perfusione gravità, cioè usando una siringa con stantuffo rimosso, un rubinetto a 3 vie, e ~ 20 centimetri di tubi con 1.5inch, 21-gauge. Mantenere la siringa a ~ 20cm sopra l'animale utilizzando un supporto ad anello. Assicurarsi che tutta l'aria viene rimossa dal tubo di perfusione. Tagliare l'atrio destro per drenare il sangue, impedendogli di tornare ai polmoni. Taglio l'atrio sinistro per permettere il drenaggio del sangue facile e perfusato dai polmoni può anche essere utile, ma non è necessario. Inserire l'ago nella base del ventricolo destro e aprire il rubinetto di perfusione polmonare con una soluzione di nitroprussiato eparina e sodio (50U/ml e 1ug/ml, rispettivamente) in PBS. Verificare che l'arteria polmonare si riempie di liquido di perfusione, e che il sangue è radura dai polmoni. Se necessario, riempire la siringa con il liquido di perfusione aggiuntivi. Tipicamente solo 10ml ~ è richiesto. Continuare fino a quando la perfusione polmonare sono chiari di sangue, poi si ferma perfusione. Sezionare il libero trachea, fino al collo per quanto possibile. Garantire trachea è separato dal esofago. Sezionare tutte le connessioni rimanenti al cuore, polmoni e trachea, e rimuovere in blocco. Usando un bisturi o taglienti forbici, tagliare l'apice del cuore, esponendo i ventricoli destro e sinistro. Cannulate il tronco polmonare attraverso il ventricolo destro, e la sutura al suo posto. Rimuovere qualsiasi tessuto in eccesso del ventricolo sinistro. Cannulate la trachea e la sutura al suo posto. Assicurarsi che sia la cannula tracheale e polmonare arteriosa sono posizionati in modo tale che non ci sia lo stress torsionali sulla trachea, polmoni, o grossi vasi (Figura 1). Assicurarsi che non ci siano bolle d'aria nella cannula arteriosa, dal momento che bolle d'aria intrappolate nel sistema può impedire il flusso costante di attraverso l'organo. In alcuni casi, una bolla d'aria può completamente fermare flow.To fluido ottenere questo risultato, luogo del cuore / polmone blocco in un vaso contenente PBS. Utilizzare una siringa con ago per iniettare una piccola quantità di PBS nella cannula cuore di espellere eventuali bolle. Lavaggio delle vie aeree con PBS 4-5 volte, per eliminare l'aria il più possibile dal polmone. Dopo il passaggio lavandas sono completi, gonfiare il polmone con PBS contenente sodio nitroprussiato (SNP) a 1ug/ml. Mettere un tappo sulla cannula tracheale, per cui la soluzione rimane nel polmone. Lasciare che il polmone di incubare per 30 minuti, come la stessa soluzione passa attraverso il sistema vascolare attraverso l'arteria polmonare, per permettere vasodilatazione. Collegare cuore / polmoni per un berretto bioreattore utilizzando il luer-lock connessioni legate alla forma di Y cannule, descritto in "Assemblea bioreattore" di cui sopra. (Figura 1). 3. Organo Decellularization Collegare il tappo (con i polmoni in allegato) agli apparecchi decellularization (Figura 1). La cannula arteriosa polmonare dovrebbe collegarsi alla linea di perfusione, e la cannula tracheale dovrebbe flottante. Assicurarsi che tutte le linee sono chiare d'aria. Come descritto in precedenza, l'aria nelle linee può essere una fonte di decellularization poveri, impedendo il flusso di liquido decllularization. L'aria intrappolata nel sistema può anche persistere nel tempo la cultura, quando essa potrebbe avere un impatto negativo sulla sopravvivenza delle cellule 3. Gonfiare il polmone con PBS / SNP fino polmoni sono pieni, ma non troppo inflazionato. Immediatamente cappuccio della cannula tracheale in modo che il polmone rimane gonfiato. Perfusione polmonare con PBS / SNP per almeno 15 min a ~ 15 mmHg (20 cm H 2 O di pressione). Dopo 15 minuti o più, togliere il tappo dalla cannula tracheale per consentire al polmone a sgonfiarsi. Continua perfusione con PBS / SNP per 30min. Se necessario, riempire PBS / SNP per garantire la pressione di perfusione è mantenuta a 10-15 mmHg. Iniziare perfusione con soluzione decellularization (CHAPS 8mm, 1M NaCl, 25mM EDTA in PBS 1X). Aver cura di garantire tutte le linee sono chiare d'aria. Un sistema di vuoto può essere utile per fornire aspirazione. Profumato con la soluzione decellularization fino a 500 ml di soluzione ha perfuso attraverso il polmone. Pressione ottimale è <15 mmHg (~ 20 cm H 2 O). Questo di solito richiede 2,5 ore. Le portate sono in genere molto lento (0.2-0.5ml/minute) inizialmente, e di aumentare rapidamente nel corso della seconda ora a circa 1ml/minute o superiore. Periodicamente, rimuovere il liquido decellularization utilizzati da bioreattore, assicurando abbastanza fluido rimane per sostenere il polmone e cannula tracheale. 4. Lavaggio e sterilizzazione degli organi Trasferimento del polmone e bioreattori a un cappuccio coltura di tessuti. Iniziare risciacquo con PBS sterile, eliminando il barattolo da 500 ml che conteneva il liquido decellularization e la sostituzione con un vasetto sterile contenente fino a 1 litro di PBS sterile. Usa aspirazione vuoto per garantire le linee sono chiare d'aria. Profumato PBS attraverso il sistema vascolare a 10-15 mmHg, nello stesso modo come per decellularization. Periodicamente, rimuovere i rifiuti dalla PBS bioreattore e sostituire e / o di riempire il vaso con PBS fresco, PBS sterile. Si consiglia di usare la tecnica sterile. Continuare a sciacquare fino a quando almeno 2,5 l di PBS sterile hanno perfusi del polmone. Trasferimento del polmone ad un nuovo sistema di bioreattore sterili contenenti PBS fresco. Assicurarsi che sia la perfusione intero ciclo e le linee aeree intero sono pieni di liquido. Tutte le fasi successive si utilizza una pompa di perfusione pulsatile i polmoni a 5ml/min. Sterilizzare il patibolo, tramite perfusione durante la notte con PBS + 10% FBS + 10% pen-streptococco soluzione o per 3 ore con 0,1% di acido peracetico in PBS. Quest'ultimo necessita di risciacquo del polmone con 3 cambi di 250ml PBS per diverse ore per rimuovere l'acido residuo. Per ogni lavaggio, il polmone deve essere ventilato e perfuso per garantire che tutte le parti del tessuto perfetta efficienza. Trasferire il polmone a 37 ° C in incubatore e profumato con PBS che ha il 10% FBS e il 10% penicillina / streptomicina per ~ 1 ora o fino a quando la temperatura è equilibrato, in preparazione per il trattamento benzonasi. Trattare polmone con benzonasi per rimuovere il DNA residuo: Caldo il buffer benzonasi (vedi tabella dei reagenti) a 37 ° C. Per ogni polmone, riempire una siringa da 10 ml con tampone benzonasi solo e una siringa da 10 ml con benzonasi 90U/ml nel buffer. Interrompere la perfusione del polmone. Gonfiare le vie aeree con tampone benzonasi. Lasciare che il polmone a sgonfiarsi (per ~ 1 minuto). Poi, gonfiare il polmone con la soluzione benzonasi. Durante l'inflazione con il tampone benzonasi & benzonasi, cercare di evitare di iniettare l'aria nei polmoni. Lasciare che il polmone di sedersi senza perfusione o ventilazione a 37 ° C per 1 ora dopo il gonfiaggio con benzonasi. Riprendere con la perfusione + PBS 10% FBS, 10% penicillina / streptomicina che è già nel bioreattore, e continuare durante la notte. Il giorno seguente, il polmone può essere conservato a 4 ° C (per un massimo di 3 mesi) o preparati per la semina delle cellule. Per preparare il patibolo per ripopolamento cellulare, sostituire la PBS / FBS / soluzione benzonasi con ~ 250 ml di terreno di coltura. Profumato per almeno un'ora prima che le cellule vengono introdotte, un° sostituzione con terreno di coltura fresco direttamente prima di seminare le cellule. 5. Recellularization La scelta della fonte di cellule per la nuova semina organo è lasciata ai singoli ricercatori. Molte fonti di cellule può essere utilizzata, comprese le popolazioni disponibili in commercio, appena isolate cellule neonatali o polmonare fetale, le cellule staminali embrionali, o cellule fonti disponibili in commercio. Protocolli di isolamento specifici per queste popolazioni di cellule può essere trovato altrove 4,5,6. Qui forniamo istruzioni su come semi sia le popolazioni delle cellule endoteliali ed epiteliali. Semina endoteliale: Preparare una sospensione di desiderato popolazione di cellule endoteliali, nel terreno di coltura appropriato. Cellula sospensione filtrare attraverso un colino per eliminare cellule 40um grumi di cellule. Una semina tipica endoteliali nel nostro laboratorio avrebbero utilizzato circa 30 milioni di ratto polmone cellule endoteliali microvascolari in 60ml di terreno di coltura. Dispensare sospensione cellulare in un piccolo serbatoio temporaneamente incorporata nel ciclo perfusione del bioreattore (Figura 2). Assicurarsi che il tubo da questo serbatoio e l'intero ciclo di perfusione è chiaro di bolle d'aria. Infondere cellule in arteria polmonare a 3ml/min utilizzando una pompa a rulli. Dopo l'infusione delle cellule, continuare perfusione con mezzo di ricircolo dal bioreattore principale a frequenza desiderata. Su base giornaliera, in modo che il tubo perfusione è chiaro di bolle d'aria. Medio dovrebbe essere sostituito con mezzo fresco regolarmente, questo è spesso fatto ogni 3-4 giorni. Semina epiteliale: Preparare una sospensione di cellule della popolazione desiderata delle cellule epiteliali. Nel nostro laboratorio, questo consiste tipicamente di circa 50-100 milioni di cellule di ratto neonatale polmonare. Filtrare la popolazione attraverso il filtro delle cellule 40um e sospendere in 15ml di terreno di coltura in una siringa. Riempire il serbatoio delle vie aeree con 80ml di terreno di coltura. Posizionare il bioreattore a 37 ° C tessuto cultura incubatore, e collegare la pompa a siringa per la ventilazione. Assicurarsi che tutte le linee sono chiare ventilazione di aria. Semi di cellule nel polmone, iniettando 15 ml di sospensione cellulare in un unico bolo nella cannula tracheale. Iniziare immediatamente un unico respiro lento utilizzando la pompa a siringa. Questo respiro è amministrato da ritiro 60ml di aria dal bioreattore principale 3ml/minute, quindi della durata di circa 20 minuti. Assicurarsi che i filtri dell'aria sul bioreattore principale sono ricoperti immediatamente dopo l'iniezione e la sospensione cellulare prima di iniziare il respiro lento. Lasciare i polmoni di sedersi staticamente per circa 18hrs, e poi iniziare a lenta perfusione vascolare (circa 0,5 ml / min). 6. Organo Cultura Sebbene i dettagli di perfusione e ventilazione variano in base alla progettazione sperimentale, i seguenti punti sono noti: Durante cultura endoteliale, la perfusione è tipicamente effettuata a 1-3 ml / min con una pompa a rulli. Durante cultura epiteliale, la ventilazione è tipicamente fornita a un tasso costante di 1 respiro al minuto con una pompa a siringa. Ritiro di 5-10ml di aria dal bioreattore principale è in genere necessario effettuare la ventilazione polmonare a un volume normale di marea. A causa della necessità di mantenere la tenuta bioreattore durante la ventilazione, la ventilazione dovrebbe essere messo in pausa ogni giorno e l'aria nella camera principale dovrebbe essere scambiati. Tutta l'aria nel sistema è aria della stanza, che è circa il 21% di ossigeno a pressione parziale. Il 5-10ml di aria dal ritiro del bioreattore (che induce una 5-10ml ispirazione del fluido del polmone) si basa sulle dimensioni del polmone e quanti lobi vengono colti (lobi possono essere legati off per l'analisi, mentre il lobi rimanenti continuano a cultura). La quantità di aria ritirato dalla pompa siringa è scelto di approssimare il "volume corrente" del polmone colta. Medio dovrebbe essere cambiato circa ogni 3-4 giorni durante cultura. Durante la co-cultura di entrambe le epitelio ed endotelio, gli esperimenti di laboratorio nel nostro solito prima l'epitelio per 4-8 giorni, durante i quali è ventilato l'ingegneria tessutale. L'endotelio viene poi seminato attraverso perfusione, dopo di che il tessuto sia perfuso e ventilato. 7. Rappresentante dei risultati: Decellularization Quando il protocollo è eseguita correttamente, i polmoni appena estratti dovrebbe tenere l'aria senza perdite. Gonfiaggio con aria in immersione in un liquido può controllare questo – non ci dovrebbero essere tutte le bolle che indicano perdite d'aria. Il decellularization successivo dovrebbe consentire ~ 500 ml di liquido decellularization a fluire attraverso i polmoni, nel corso di 2,5 – 3 ore a 37 ° C, e PBS dovrebbe alla fine essere in grado di fluire attraverso i polmoni a circa 10 ml / min (sotto ~ 15 mm Hg della pressione idrostatica) alla fine del lavaggio. Dopo il trattamento con 0,1% di acido peracetico e benzonasi, i polmoni possono essere conservati a 4 ° C per un massimo di 3 mesi, e ancora adatto per recellularization. La matrice extracellulare decellularized finale deve essere completamente privo di materiali cellulari, e conservino le caratteristiche lordo, microscopica e ultrastrutturale del polmone nativo. Decellularization insufficiente o risciacquo può provocare resto DNA "attaccare" al patibolo, che può essere visualizzato con una standard e ematossilina eosina (vedi Figura 3 per il confronto). Ripopolamento di matrice acellulare e della cultura del tessuto polmonare Se le cellule vengono isolate da appena 7 giorni cuccioli di ratto vecchio neonatale, come descritto nel supplemento linea che accompagna il lavoro di Petersen e colleghi 4, ci si può aspettare una resa cellula di 120-150 milioni di cellule per ogni cucciolata di 10 cuccioli (poco più di 10 milioni celle per neonato). Condizioni ottimali per la semina delle cellule e la cultura successiva del polmone nel bioreattore dovrebbe produrre ben distribuita all'interno di tutte le cellule 5 lobi del polmone, e dovrebbe fornire una copertura di circa il 70% della matrice extracellulare patibolo (Figura 3). La popolazione di cellule in coltura sarà positiva per i principali marcatori delle cellule delle vie respiratorie, come pro-secretoria proteina-C (SPC), proteina secretoria delle cellule di Clara (CCSP), e aquaporin-5 (AQP), in ordine di abbondanza relativa (Figura 4). Figura 1. Posizioni cannule e bioreattore decellularization Figura 2. Bioreattori usati per la semina e la cultura del tessuto polmonare ingegnerizzati Figura 3. Istologia di natale, decellularized, e ripopolata polmone Figura 4. Colorazione di immunofluorescenza per gli indicatori chiave del polmone