iClip - Transkriptom-weiten Mapping von Protein-RNA Wechselwirkungen mit Individual Nucleotide Resolution

1. UV-Vernetzung von Gewebekulturzellen Entfernen Sie die Medien und 6 ml eiskaltem PBS, um Zellen in einer 10 cm Platte (reicht für drei Versuchen) gewachsen. Entfernen Sie den Deckel und auf Eis stellen. Bestrahlen einmal mit 150 mJ / cm 2 bei 254 nm. Ernten Sie die Zellen, die durch Kratzen mit einem Zell-Lifter. Transfer 2 ml Zellsuspension jeweils drei Röhrchen. Spin bei Höchstgeschwindigkeit für 10 sec bei 4 ° C zu Pellet-Zellen, dann entfernen Überstand. Snap-freeze die Zellpellets auf Trockeneis und bei -80 ° C bis zur Verwendung. 2. Bead Vorbereitung 100 l Protein A Dynabeads (Dynal, 100,02) pro Experiment zu einem frischen Mikroröhrchen (Use Protein G Dynabeads für eine Maus oder Ziege-Antikörper). Wash Perlen 2x mit Lysepuffer (50 mM Tris-HCl, pH 7,4, 100 mM NaCl, 1% NP-40, 0,1% SDS, 0,5% Natriumdeoxycholat; 1 / 100 Protease-Inhibitor-Cocktail III, Calbiochem). Resuspendieren Perlen in 100 ul Lysepuffer mit 2-10 pg Antikörper. Drehen Röhrchen bei Raumtemperatur für 30-60 min. Waschen mit 900 ul Lysepuffer 3x und verlassen in der letzten Waschung bis bereit, um fortzufahren auf 4,1 Schritt. 3. Zelllyse und partielle RNA Verdauung Zellpellet in 1 ml Lysepuffer und Transfer bis 1,5 ml Röhrchen. Bereiten Sie eine 1 / 500 Verdünnung von RNase I (Ambion, AM2295). Fügen Sie 10 ul RNase I Verdünnung sowie 2 ul Turbo DNase dem Zelllysat (1 / 500 RNase I Verdünnungen [low RNase] sind für die Bibliothek der Zubereitung verwendet, 1 / 50 Verdünnungen [high RNase] notwendig sind, um für die Antikörper-Spezifität control) . Inkubieren Sie die Proben für exakt 3 min bei 37 ° C, Schütteln bei 1.100 Umdrehungen pro Minute. Sofort auf Eis zu übertragen. Spin bei 4 ° C und 22.000 g für 20 min zum Lysat klar. Vorsichtig den Überstand (leave etwa 50 ul Lysat mit dem Pellet). 4. Immunpräzipitation Entfernen Sie den Waschpuffer aus den Perlen (aus Schritt 2,5), dann fügen Sie das Zelllysat (aus Schritt 3.4). Drehen Sie die Proben für 2 h bei 4 ° C. Überstand verwerfen und waschen Sie die Perlen 2x mit 900 ul High-Salz-Puffer (50 mM Tris-HCl, pH 7,4, 1 M NaCl, 1 mM EDTA, 1% NP-40, 0,1% SDS, 0,5% Natriumdeoxycholat). Wash 2x mit 900 ul Waschpuffer (20 mM Tris-HCl, pH 7,4, 10 mM MgCl 2, 0,2% Tween-20). 5. Dephosphorylierung von RNA 3'-Enden Verwerfen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Kügelchen in 20 ul PNK-Mix (15 ul Wasser, 4 ul 5x PNK pH 6,5-Puffer [350mMTris-HCl, pH 6,5; 50mMMgCl 2 25mMdithiothreitol]; 0,5 ul PNK Enzym, 0,5 ul RNasin [Promega]). Inkubieren für 20 min bei 37 ° C. Add 500 ul Waschpuffer waschen 1x mit Hochsalzpuffer. Wash 2x mit Waschpuffer. 6. Linkerligation bis 3 'Enden RNA Entfernen Sie vorsichtig den Überstand und resuspendieren Sie die Perlen in 20 ul Ligationsgemisch (9 ul Wasser, 4 ul 4x Ligationspuffer [200 mM Tris-HCl, 40 MM GCL 2; 40 mM Dithiothreitol], 1 ul RNA-Ligase [NEB]; 0,5 ul RNasin [Promega]; 1,5 ul pre-adenylierte Linker L3 [20 uM]; 4 ul PEG400 [81170, Sigma]). Inkubieren über Nacht bei 16 ° C. Add 500 ul Waschpuffer und dann waschen mit 1 ml Hochsalzpuffer 2x. Wash 2x mit 1 ml Waschpuffer und in 1 ml der zweiten waschen zu lassen. 7. RNA 5 'Ende Kennzeichnung Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Perlen in 8 ul heißen PNK-Mix (0,4 ul PNK [NEB], 0,8 ul 32 P-γ-ATP, 0,8 ul 10x PNK-Puffer [NEB]; 6 ul Wasser). Inkubieren für 5 min bei 37 ° C. Entfernen Sie die heißen PNK-Mix und resuspendieren die Perlen in 20 ul 1x NuPAGE Ladepuffer (Invitrogen). Inkubieren auf einem Thermomixer bei 70 ° C für 10 min. Unmittelbar auf einem Magneten Ort, um Niederschlag der leeren Perlen und Last der Überstand auf das Gel (siehe Schritt 8). 8. SDS-PAGE und Membran übertragen Laden Sie die Proben auf einem 4-12% NuPAGE Bis-Tris-Gel (Invitrogen) entsprechend den Anweisungen des Herstellers. Verwenden Sie 0,5 l 1x MOPS-Laufpuffer (Invitrogen). Auch Last 5 ul einer pre-gefärbten Protein-Größenmarker (zB PAGE Herrscher plus, Fermentas, SM1811). Führen Sie das Gel für 50 min bei 180 V. Entfernen Sie das Gel vor und entsorgen Sie als feste Abfälle (enthält freie radioaktive ATP). Übertragen Sie die Protein-RNA-Komplexen aus dem Gel auf eine Nitrozellulosemembran mit dem Novex nassen Übertragung gemäß den Anweisungen des Herstellers (Invitrogen, je 1 h bei 30 V). Nach der Übertragung, spülen Sie die Membran in PBS-Puffer, dann wickeln Sie es in Frischhaltefolie und setzen Sie es zu einem Fuji-Film bei -80 ° C (statt einem fluoreszierenden Aufkleber neben der Membran zu einem späteren Zeitpunkt align ter Film und die Membran; durchführen Forderungen für 30 min, 1h und über Nacht). 9. RNA-Isolierung Isolieren Sie die Protein-RNA-Komplexen aus dem Low-RNase Experiment mit dem Autoradiogramm von Schritt 8.5 als eine Maske. Cut dieses Stück Membran in mehrere kleine Scheiben schneiden und diese in ein 1,5 ml Mikroröhrchen. Geben Sie 200 ul PK-Puffer (100 mM Tris-HCl pH 7,4, 50 mM NaCl, 10 mM EDTA) und 10 ul Proteinase K (Roche, 03115828001) an die Membran Stücke. Inkubieren Schütteln bei 1.100 rpm für 20 min bei 37 ° C. Add 200 ul PKurea Puffer (100 mM Tris-HCl pH 7,4, 50 mM NaCl, 10 mM EDTA, 7 M Harnstoff) und Inkubation für 20 min bei 37 ° C. Sammeln Sie die Lösung und fügen Sie ihn zusammen mit 400 ul RNA Phenol / Chloroform (Ambion, 9722) zu einem 2 ml Phase Lock Gel Schwere Rohr (713 bis 2536, VWR). Inkubieren für 5 min bei 30 ° C, Schütteln bei 1.100 Umdrehungen pro Minute. Trennen Sie die Phasen, durch Drehen für 5 min bei 13.000 rpm bei Raumtemperatur. Übertragen Sie die wässrige Schicht in ein neues Röhrchen (darauf achten, nicht auf das Gel mit der Pipette berühren). Add 0,5 ul glycoblue (Ambion, 9510) und 40 ul 3 M Natriumacetat pH 5,5 und mischen. Dann fügen Sie 1 ml 100% Ethanol, nochmals mischen und Niederschlag über Nacht bei -20 ° C. 10. Reverse Transkription Spin für 20 min bei 15.000 rpm und 4 ° C. Entfernen Sie den Überstand und wäscht das Pellet mit 0,5 ml 80% Ethanol. Das Pellet in 7,25 ul RNA / Primer-Mix (6,25 &mgr; l Wasser, 0,5 ul Rclip Primer [0.5pmol/μl]; 0,5 ul dNTP-Mix [10 mM]). Für jedes Experiment oder replizieren, verwenden Sie ein anderes Rclip Primer mit individuellen Barcode-Sequenzen (siehe 14). Inkubieren für 5 min bei 70 ° C vor dem Abkühlen auf 25 ° C. Add 2,75 ul RT-Mix (2 ul 5x RT-Puffer, 0,5 ul 0,1 M DTT, 0,25 ul Superscript III-Reverse-Transkriptase [Invitrogen]). Inkubieren 5 min bei 25 ° C, 20 min bei 42 ° C, 40 min bei 50 ° C und 5 min bei 80 ° C vor dem Abkühlen auf 4 ° C. Add 90 ul TE-Puffer, 0,5 ul glycoblue und 10 ul Natriumacetat pH 5,5 und mischen. Dann fügen Sie 250 ul 100% Ethanol, nochmals mischen und Niederschlag über Nacht bei -20 ° C. 11. Gel Reinigung der cDNA Spin nach unten und waschen Sie die Proben (siehe 10,1), dann das Sediment resuspendieren in 6 l Wasser. Add 6 ul 2x TBE-Harnstoff-Ladepuffer (Invitrogen). Hitze Proben bis 80 ° C für 3 min direkt vor dem Laden. Laden Sie die Proben auf einem vorgefertigten 6% TBE-Harnstoff-Gel (Invitrogen) und führen Sie für 40 min bei 180 V, wie vom Hersteller beschrieben. Auch Last mit niedrigem Molekulargewicht-Marker für die spätere Schneiden (siehe unten). Cut drei Bands bei 120-200 nt (hoch), 85-120 nt (medium) und 70-85 nt (low). Verwenden Sie theupper Farbstoff und die Markierungen auf der Kunststoff-Gel unterstützt Exzision Guide (siehe Abbildung 3). Beachten Sie, dass die Rclip Primer und der L3-Sequenz machen zusammen über 52 nt der CLIP-Sequenz. Add 400 ul TE zugeben und Gelscheibe in kleine Stücke mit einer 1 ml Spritze Kolben. Inkubieren Schütteln bei 1.100 rpm für 2 h bei 37 ° C. Legen Sie zwei 1 cm Glas Vorfilter (Whatman, 1823010) in eine Costar SpinX Spalte (Corning Incorporated, 8161). Die Flüssigkeit Teil der Probe auf die Säule. Spin für 1 min bei 13.000 rpm in ein 1,5 ml-Tube. Add 0,5 ul glycoblue und 40 ul Natriumacetat pH 5,5, dann mischen Sie die Probe. 1 ml 100% Ethanol, nochmals mischen und Niederschlag über Nacht bei -20 ° C. 12. Ligation der Primer 5'-Ende der cDNA Spin nach unten und waschen Sie die Proben (siehe 10,1), dann das Sediment resuspendieren in 8 ul Ligationsgemisch (6,5 ul Wasser, 0,8 ul 10x CircLigase Buffer II, 0,4 ul 50 mM MnCl 2, 0,3 ul; Circligase II [Epicentre]) und inkubieren 1 h bei 60 ° C. Zugabe von 30 ul Oligo Glühen Mix (26 ul Wasser, 3 ul FastDigest Buffer [Fermentas], 1 ul cut_oligo [10 uM]). Inkubation für 1 min bei 95 ° C. Dann verringern Sie die Temperatur alle 20 sec um 1 ° C bis 25 ° C erreicht sind. Add 2 ul BamHI (Fast Fermentas) und Inkubation für 30 min bei 37 ° C. Dann werden 50 ul TE und 0,5 ul glycoblue und mischen. Fügen Sie 10 ul Natriumacetat pH 5,5 und mischen, dann fügen Sie 250 ul 100% Ethanol. Mix wieder und Niederschlag über Nacht bei -20 ° C. 13. PCR-Amplifikation Spin nach unten und waschen Sie die Proben (siehe 10,1), dann das Pellet in 19 ul Wasser. Bereiten Sie die PCR-Mix (19 ul cDNA, 1 ul Primer-Mix P5/P3 Solexa, 10 uM jedes, 20 ul Accuprime Supermix 1-Enzym [Invitrogen]). Führen Sie den folgenden PCR-Programm: 94 ° C für 2 min, [94 ° C für 15 sec, 65 ° C für 30 sec, 68 ° C für 30 sec] 25-35 Zyklen, 68 ° C für 3 min, 4 ° C für immer. Mix 8 ul PCR-Produkt mit 2 ul 5x TBE-Ladepuffer und Last auf einem vorgefertigten 6% TBE-Gel (InvitRogen). Stain das Gel mit SybrGreen I (Invitrogen) und zu analysieren, mit einem Gel-Imager. Der Barcode in der Rclip Primer erlauben Multiplex verschiedenen Proben vor der Einreichung für Hochdurchsatz-Sequenzierung. Submit 15 ul der Bibliothek für die Sequenzierung und speichern Sie die Ruhe. 14. Linker und Primersequenzen Pre-adenylierte 3 'Linker-DNA: [Wir bestellen die DNA-Adapter von IDT und dann Aliquots von 20 um.] 15. Repräsentative Ergebnisse: Vor Sequenzierung des iClip Bibliothek kann der Erfolg des Experiments auf zwei Schritte überwacht werden: die Autoradiogramm des Protein-RNA-Komplex nach Membran übertragen (Schritt 8,5) und das Gel Bild der PCR-Produkte (Schritt 13,4). Im Autoradiogramm des Low-RNase Proben sollten diffuse Radioaktivität über dem Molekulargewicht des Proteins (Abbildung 2, Probe 4) gesehen werden. Für High-RNase Proben ist diese Radioaktivität konzentriert näher an das Molekulargewicht des Proteins (Abbildung 2, Probe 3). Wenn keine Antikörper in der Immunpräzipitation verwendet wird, sollte kein Signal erkannt wird (Abb. 2, Proben 1 und 2). Weitere wichtige Steuerelemente für die Spezifität der Immunpräzipitation entweder weglassen UV-Bestrahlung oder Zellen, die nicht exprimieren das Protein von Interesse 14. Das Gel Bild der PCR-Produkte (Schritt 13.4) sollte eine Größenordnung, die die cDNA Fraktion (hoch, mittel oder niedrig) in Schritt 11,4 (Abbildung 4, Spuren 4-6) gereinigt entspricht. Beachten Sie, dass die PCR-Primer P3Solexa und P5Solexa eine zusätzliche 76 nt einzuführen, um die Größe der cDNA. Wenn keine Antikörper während der Immunpräzipitation verwendet wird, sollte keine entsprechende PCR-Produkten nachgewiesen werden (Abbildung 4, Spuren 1-3). Primer-Dimer Produkt kann bei etwa 140 nt erscheinen. Für repräsentative Ergebnisse der Hochdurchsatz-Sequenzierung und anschließende bioinformatischen Analysen siehe 14. Abbildung 1. Schematische Darstellung der iClip-Protokoll. Protein-RNA-Komplexen sind kovalent in vivo mittels UV-Bestrahlung (Schritt 1)-vernetzt. Das Protein von Interesse ist zusammen mit der gebundenen RNA (Schritte 2-5) gereinigt. Um für die Sequenz-spezifische Grundierung der reversen Transkription wird eine RNA-Adapter an den 3 ligiert 'Ende der RNA, während das 5'-Ende radioaktiv markiert wird (Schritt 6 und 7). Vernetzte Protein-RNA-Komplexe werden von freien RNA mittels SDS-PAGE und Membran übertragen (Schritt 8) gereinigt. Die RNA wird von der Membran durch Verdau des Proteins mit Proteinase K Verlassen eines Polypeptids Verbleib in der Cross-Link Nukleotid (Stufe 9) gewonnen. Reverse Transkription (RT) schneidet bei den restlichen Polypeptid und führt zwei spaltbare Adapter Regionen und Barcode-Sequenzen (Schritt 10). Größe Auswahl entfernt freies RT Primer vor Umlaufverfahren. Die folgenden Linearisierung erzeugt geeignete Vorlagen für die PCR-Amplifikation (Schritte 11-15). Schließlich erzeugt der Hochdurchsatz-Sequenzierung liest, in dem die Barcode-Sequenzen unmittelbar von den letzten Nukleotid der cDNA (Schritt 16). Da diese Nukleotid lokalisiert eine Position vor dem vernetzten Nukleotid kann die Bindungsstelle mit hoher Auflösung abgeleitet werden. Abbildung 2. Autoradiogramm vernetzten hnRNP C-RNA-Komplexen mit denaturierende Gelelektrophorese und Membran übertragen. hnRNP C-RNA-Komplexe wurden aus Zellextrakten mit einem Antikörper gegen hnRNP C Immun-gereinigt (α hnRNP C, die Proben 3 und 4). RNA wurde teilweise verdaut mit niedriger (+) oder hohen (+ +)-Konzentration von RNase. Komplexe Verschiebung nach oben aus der Größe des Proteins (40 kDa) zu beobachten (Probe 4). Die Verschiebung ist weniger ausgeprägt, wenn hohe Konzentrationen von RNase verwendet wurden (Probe 3). Das radioaktive Signal verschwindet, wenn keine Antikörper in der Immunpräzipitation verwendet wurde (Proben 1 und 2). Abbildung 3. Schematische 6% TBE-Harnstoff-Gel (Invitrogen) zur Führung der Exzision iClip cDNA-Produkte. Das Gel wird für 40 min bei 180 V führt zu einem reproduzierbaren Migration Muster von cDNAs und Farbstoffe (hell-und dunkelblau) in das Gel laufen. Verwenden einer Rasierklinge zu schneiden (rote Linie) die hohe (H), medium (M) und niedrig (L) cDNA-Fraktionen. Beginnen Sie mit dem Schneiden in der Mitte des hellblauen Farbstoff und unmittelbar oberhalb der Markierung auf der Kunststoff-Gel-Kassette. Teilen Sie die mittleren und niedrigen Fraktionen und schneiden den hohen Anteil von etwa 1 cm oberhalb der leichten blauen Farbstoff. Verwenden Sie vertikale Schnitte durch die Taschen und der Farbstoff geführt, um die verschiedenen Bahnen (in diesem Beispiel 1-4) zu trennen. Der Marker Spur (m) ergibt gebeizt und abgebildet, die KontrolleGrößen nach dem Schneiden. Fragmentgrößen sind auf der rechten Seite angegeben. Abbildung 4. Analyse von PCR-amplifizierten iClip cDNA-Bibliotheken unter Verwendung von Gel-Elektrophorese. RNA erholte sich von der Membran (Abbildung 1) wurde revers transkribiert und die Größe der unter Verwendung denaturierende Gelelektrophorese (Abbildung 2). Drei Kornfraktionen von cDNA (hohe [H]: 120-200 nt-, mittel-[M]: 85-120 nt und niedrige [L]: 70-85 nt) wurden gewonnen, zirkularisiert, wieder linearisiert und PCR-amplifiziert. PCR-Produkte von unterschiedlichen Größenverteilung kann als Ergebnis der unterschiedlichen Größen der Eingangs-Fraktionen beobachtet werden. Da die PCR-Primer stellt 76 nt der cDNA sollte Größen zwischen 196-276 nt für hohe, 161-196 nt Bereich für mittlere und 146-161 nt für geringe Größe Fraktionen. PCR-Produkte fehlen, wenn keine Antikörper für die Immunpräzipitation (Spuren 1-3) verwendet wurde.