Generazione di piante Composite in Medicago truncatula Per saggi nodulazione

Il seguente protocollo è stato utilizzato per generare piante radice pelosa composito in una specie di legume modello M. truncatula. Protocolli simili sono stati adattati per almeno otto specie vegetali 1-4. Abbiamo usato M. piante radice truncatula peloso composito per studiare le funzioni del gene in radice e lo sviluppo dei noduli. Il protocollo è stato suddiviso in quattro sezioni: 1) i materiali vegetali preparazione, 2) impianti di generazione radice pelosa compositi; 3) simbiotica Rhizobium infezione e 4) l'identificazione radice transgenici. Abbiamo utilizzato il vettore binario contenente la proteina verde fluorescente (GFP) gene come reporter per lo screening radici nelle piante transgeniche composito 3. Rispetto agli antibiotici a base di selezione, GFP-screening è veloce, facile e poco costoso. Nel nostro costrutto, la ER-espressione del gene GFP-ottimizzato è guidata dal promotore super-ubiquitina, che ha forti segnali GFP costitutivo nelle radici transgenici, che permette di distinguere agevolmente le radici transgeniche e non transgeniche. 1. Preparazione Piante M. semi truncautla sono raccolti da piante coltivate in una serra (50% di umidità relativa, 16 / 8 h luce / buio, 22/18 ° C giorno / notte temperatura). Semi maturi possono essere conservati a 4 ° C. Circa 100 semi sono scarificati in 10 ml di acido solforico concentrato (95-98%, Sigma-Aldrich, MO) per 10 minuti con agitazione periodica. I semi sono 5-7 volte risciacquati con acqua sterile e scuotendo con cautela. I semi vengono poi immersi in acqua a temperatura ambiente per 6 ore e conservato a 4 ° C per 36-48 ore per sincronizzare la germinazione. Circa il 20-30 semi sono diffuse su suoli umidi carte da filtro posto in una capsula di Petri. Essi sono mantenuti a 22 ° C, con 16 / 8 h ciclo luce / buio, e 40 μmol.m -2. S -1 intensità della luce, per 5-6 giorni. Piantine germinate vengono trasferiti nel terreno e messo in serra per un mese. 2. Generazione Piante Root Peloso Composite Costruisce binari che trasportano i geni di interesse sono state trasformate in A. rhizogenes utilizzando protocolli standard. Abbiamo progettato una serie di vettori binari contenenti il gene GFP come marcatore che facilitano il controllo dei tessuti transgenici. Questi vettori contengono vari promotori e tutti hanno siti clonazione Gateway (Invitrogen, Carlsbad, CA) per la sovra-espressione o silenziamento dei geni mirati 3,5. Rhizogenes A. è coltivato in 50 ml di media LB con un'appropriata selezione antibiotica a 28 ° C per 16-24 ore. I batteri sono raccolte e risospese ad una concentrazione finale di 600 OD = 0.3 in una soluzione priva di impianto di azoto nutriente (Tabella 1 e 6). Per sostenere la rigenerazione peloso radice, una matrice di supporto sterilizzato ("Lana di Roccia", Hummert internazionale, Earth City, MO), viene tagliato in tasselli di circa 3 cm 3. Abbiamo posto 4 spine in una piastra di Petri. Un buco è colpito sulla parte superiore di ogni spina con un puntale per facilitare l'inserimento di espianti. A. rhizogenes (5 ml) viene aggiunto a ogni spina. Una sezione sparare con 2-3 gemme ascellari è asportato da un taglio obliquo. L'espianto viene quindi inserito nella presa, e cresciuto a 22 ° C per circa tre settimane. Manteniamo la Medicago espianti senza irrigazione per i primi 10 giorni, poi, l'acqua con 5 ml di azoto senza soluzione quando necessario. Abbiamo trovato che la rimozione del meristema apicale potrebbe diminuire la formazione di radici avventizie. 3. Simbiotica Rhizobium (Sinorhizobium meliloti) Infezione Dopo tre settimane, alcune radici avventizie uscirà dalla lana di roccia. Le piante radice pelosa compositi vengono trasferiti in sabbia o vermiculite (sterilizzato), con o senza la lana di roccia. Esse vengono coltivate in serra a 22 ° C, 16 / 8 h ciclo luce / buio, e 300 μmol.m -2. S -1 intensità della luce per una settimana di più. Prima di rizobi ​​infezione, S. meliloti 1201 è colto in 50 ml di estratto di lievito-mannitolo medio per 7 giorni a 30 ° C (tabella 2 e 6,7). Risospese cellule rizobi ​​sono diluiti ad una concentrazione finale di 600 OD = 0.08 usando la soluzione di nutrizione azoto libero. A 10 ml sospensione fresca di S. meliloti è stato applicato a ciascun impianto composito di indurre la formazione di noduli. 4. Radice di identificazione transgenici Due settimane dopo l'inoculazione rizobi, le piante composite sono sradicate dal lavaggio in acqua. Le radici possono essere facilmente separato dalla sabbia o perlite in acqua. Abbiamo posto le radici peloso sotto un microscopio a raggi UV (Nikon SMZ1500, eccitazione 460-500nm, 505nm dicroico, Barriera oltre 510nm). Le radici sono transgenici GFP positive e le radici avventizie sono GFP negativi. Abbiamo poi raccogliere le radici according il segnale GFP, e contare il numero di noduli, misurare la lunghezza radice, e calcolare la densità laterale root. Le radici GFP negativi sono utilizzati come controllo. 5. Rappresentante dei risultati Nel nostro esperimento, le radici dei capelli nuova rigenerata dal espianti in 2-3 settimane dopo la A. rhizogenes inoculazione. Sotto il microscopio a raggi UV, le radici transgenici portatori del gene GFP mostrano una forte fluorescenza verde (Fig. 1). La quantità di radici rigenerate e la parte delle radici GFP positive dipendono dalle condizioni di espianti e l'ambiente di crescita composito plants.On media, il 25% delle radici prodotte erano transgenici radici pelose 3. Per aumentare l'efficienza della trasformazione, 1) il destino coperchio di plastica, come mostrato nel video, è sufficiente per mantenere l'umidità nel cassetto crescita per i primi giorni, e solo piante richiedono poca acqua nei primi giorni. Irrigazione eccessiva è dannosa per la formazione delle radici pelose, 2) la concentrazione di innoculant Agrobacterium è importante per la trasformazione. Quantità eccessiva di cellule non sono utili alla formazione delle radici pelose o formazione di noduli. Per la formazione di noduli, la soluzione di irrigazione deve essere azoto-free, altrimenti, noduli di pochi forma. Le piante radice pelosa composito può essere generato usando cotiledoni o piantine Entact come materiale di partenza. Solo piccole modifiche del protocollo di cui sopra sono ncessary per generare radici pelose da altri tessuti 8. È importante sottolineare che ogni radice peloso è un evento di trasformazione indipendente. Pertanto, i fenotipi osservati in un impianto di compositi sono la somma di eventi diversi transforamtion che doveva essere confermata da ripetizioni in diverse piante composite Figura 1. A. radici transgeniche può essere risolto dalle radici pelose. Noduli B. si sono formati negli impianti radice pelosa composito. Abbiamo messo quattro settimane di età M. piante radice truncatula peloso sotto il microscopio a raggi UV e alle radici GFP positive possono essere facilmente identificati. (Freccia rossa: root GFP; freccia gialla: non GFP root) Stock g/200ml ml di brodo / litro MgSO 4 0,7 H 2 O 12,3 2 CaCl 2 .2 H 2 O 14,7 4 K 2 HPO 4 .3 H 2 O 6,8 1 K 2 SO 4 11 4 Fe Cl 3 .6 H 2 O 0,49 2,5 Micronutrienti Vedi sotto 1 Micronutrienti g per litro H 3 BO 3 0,142 MnSO 4. H 2 O 0,077 ZnSO 4 0,7 H 2 O 0,1725 CuSO 4 .5 H 2 O 0,037 Namoo 4. H 2 O 0,024 CoCl 2. H 2 O 0,0025 NISO 4 0,001 Tabella 1. Nitogen senza soluzione di nutrizione K 2 HPO4 0,5 g NaCl 0.1g MgSO 4 · 7H 2 O 0,2 g Estratto di Lievito 0.4g Mannitolo 10g pH = 6.8 Tabella 2. Estratto di lievito medio mannitolo (per litro)